発展途上ひよこ視蓋接線細胞移動の可視化
Summary
接線方向の移行の蛍光標識法について述べるエレクトロポレーション、および移行を視覚化するためにフラット マウント文化のラベルの付いたセルの動きのタイムラプス イメージング用セル セル開発ひよこ視蓋動作.
Abstract
タイムラプス イメージングは、移行細胞の挙動を分析する強力な方法です。蛍光細胞ラベリング後、ビデオ顕微鏡下文化の標識細胞の動きを記録できます。発展途上の脳細胞の移動を分析するためスライス培養、細胞遊走の放射状の細胞遊走などのスライス セクションに平行を観察する使用されます。しかし、限られた情報は、接線方向の細胞遊走などのスライス セクションに垂直セル移行を分析するスライス培養法から入手できます。ここでは、発展途上のひよこ視蓋接線細胞遊走を視覚化する時間経過イメージ投射のためのプロトコルを提案する.Ovo でエレクトロポレーションと細胞培養チップの後フラット マウント文化によって分類するセルの組み合わせにより、水平面内移行細胞運動の検出です。また、本手法は個々 のセルの動作と長期的に細胞のグループの集団行動の両方の検出を容易します。このメソッドは、蛍光マイクロ構造の非神経組織神経のティッシュか細胞の変位で軸索の伸長を含む連続した変化を検出する可能性があります適用ことができます。
Introduction
ライブ イメージングの進歩技術と細胞移動の研究が進み。蛍光細胞ラベリング後、ビデオ顕微鏡下で培養皿や生体内での標識細胞の時間的な動きを記録できます。神経系の発達の研究では、タイムラプス イメージングを用いた移行細胞または軸索伸長の形態学的変化を分析されてが。効果的なイメージング実験と解析の目的に基づく蛍光細胞ラベリングと組織の準備のための適切な方法を適用が欠かせません。発展途上の脳細胞の移動を分析するため細胞遊走細胞径移行1,2,3などのスライス セクションに平行を観察するスライス培養によく使用されています。スライス培養系も接線方向セル移行4,5の検出用、セルがスライス セクションに垂直を分散の場合指向性分析のため適していません。
視蓋は萌芽期の開発中に放射状および接した細胞移行によって形成された、多層構造で構成されます。蓋層形成心室の地帯から後の神経前駆細胞の放射状移動に主に左右心室ゾーン6生年と相関する層の彼らの最終目的地。接線方向の移動に関しては以前に発展途上のひよこ視蓋の真ん中と表面的な層の移行の 2 つのストリームを報告しました。E6 E8 の中に中間層で長い主要なプロセスと薄い後続プロセスと双極細胞は、7を実行する背腹側蓋の遠心性軸索軸索束に沿って背側または腹側を移行します。この axophilic 移行後、細胞は深い層にある多極神経細胞に分化します。E7 E14 中に表層で移行するセルは複数方向8分岐リード処理および散布を改質による水平方向に分散します。移行を分散後に、後者のセルは、最終的に様々 な形態の表面的なニューロンに分化します。両方のケースでは、フラット マウント文化は軟膜表面に平行細胞運動を観察するが効率的です。
ここでは、発展途上のひよここま7,8で接線方向細胞遊走を視覚化する時間経過イメージ投射のためのプロトコルを提案する.Ovoエレクトロポレーションと携帯文化にその後フラット マウント文化によって分類するセルの組み合わせにより、移行細胞の移動および移行の方向の検出です。このメソッドの目的は、長期と水平面内のセルのグループの集団行動の両方の個々 のセル動作の検出を容易にすることです。
Protocol
Representative Results
Discussion
上記で説明したプロトコルは、浅層6,8で細胞の移動を検出に最適です。エレクトロポレーション (E4.5、E5.5) のタイミングと文化の始まりをシフト イメージング (E6.0 に E7.0) だけで中間層の移行ストリーム (映画 5)6、7を検出が可能です。
提示された手順ovo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、日本学術振興会科研費助成数によって支えられた Y.W. に 15 K 06740
Materials
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
References
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