Visualisatie van tangentiële cel migratie in de ontwikkelingslanden Chick Optic Tectum
Summary
We beschrijven de methoden voor het labelen van fluorescerende tangentieel migreren cellen door electroporation, en voor time-lapse beeldvorming van de beweging van de gelabelde cel in een flat-mount cultuur om te visualiseren migreren cel gedrag in de ontwikkelingslanden chick optic tectum .
Abstract
Time-lapse imaging is een krachtige methode om te migreren cel gedrag te analyseren. Na tl cel labeling, kan het verkeer van de gelabelde cellen in cultuur onder videomicroscopie worden opgenomen. Voor het analyseren van cel migratie in de ontwikkelende hersenen, wordt segment cultuur vaak gebruikt om te observeren cel migratie parallel aan de sectie van het segment, bijvoorbeeld radiale cel migratie. Echter kan beperkte informatie worden verkregen door de methode voor het analyseren van cel migratie loodrecht op de sectie van het segment, bijvoorbeeld tangentiële cel migratie segment cultuur. Hier presenteren we de protocollen voor time-lapse denkbaar om te visualiseren tangentiële cel migratie in de ontwikkelingslanden chick optic tectum. Een combinatie van cel labeling door electroporation in ovo en een daaropvolgende flat-mount cultuur op de cel cultuur invoegen maakt detectie van migreren cel beweging in het horizontale vlak. Bovendien vergemakkelijkt onze methode detectie van zowel individuele cel gedrag en de collectieve actie van een groep cellen op de lange termijn. Deze methode kan mogelijk worden toegepast om te ontdekken de sequentiële verandering van de TL-geëtiketteerden micro-structuur, met inbegrip van de axonale rek in de neurale verplaatsing van de weefsels of cellen in de niet-zenuwweefsel.
Introduction
De studie van cel migratie heeft voortgang met de oprukkende techniek voor levende imaging. Na tl cel labeling, kan het tijdelijke verkeer van gelabelde cellen in een cultuur schotel of in vivo onder videomicroscopie worden opgenomen. In de studie van neurale ontwikkeling, hebben de morfologische veranderingen van cellen migreren of grondvlak axonen zijn geanalyseerd met behulp van time-lapse imaging. Voor effectieve beeldvorming is het essentieel een geschikte methode voor fluorescerende cel labeling en weefsel preparaat, gebaseerd op het doel van het experiment en de analyse toe te passen. Voor het analyseren van cel migratie in de ontwikkelende hersenen, heeft segment cultuur zijn gebruikte om te observeren cel migratie parallel aan de sectie van het segment, bijvoorbeeld radiale cel migratie,1,,2,3. Het segment cultuur systeem wordt ook gebruikt voor het opsporen van tangentiële cel migratie4,5, maar het is niet geschikt voor directionele analyse in gevallen waar de cellen loodrecht naar de segment-sectie verspreiden.
De optische tectum bestaat uit een meerdere lagen structuur, gevormd door radiaal en tangentieel cel migratie tijdens de embryonale ontwikkeling. Tectal laag vorming is voornamelijk afhankelijk van radiale migratie van neuronale voorlopercellen van de ventriculaire zone postmitotic, en hun eindbestemming in de lagen correleert met hun geboortedatum in de ventriculaire zone6. Wat betreft de tangentiële migratie meldden we eerder twee stromen van migraties in de oppervlakkige en middelste lagen in een derde kuiken optic tectum. In de middelste lagen tijdens E6-E8 migreren de bipolaire cellen met een lange leidende proces en een dunne achterstand proces dorsally of ventrally langs de axon arcuatus van tectal efferent axonen uitvoert dorso-ventrally7. Na de migratie van deze axophilic onderscheiden de cellen in de multipolaire neuronen zich in de diepe lagen. In de oppervlakkige lagen tijdens E7-E14 verspreiden de migreren cellen horizontaal door de hervorming van een vertakte leidende proces en scatter in meerdere richtingen8. Na de migratie te verspreiden, onderscheiden de laatstgenoemde cellen uiteindelijk in oppervlakkige neuronen van verschillende morphologies. In beide gevallen is een flat-mount cultuur efficiënt om te observeren cel beweging parallel aan het pial oppervlak.
Hier presenteren we een protocol voor time-lapse denkbaar om te visualiseren tangentiële cel migratie in de ontwikkelingslanden chick optic tectum7,–8. Combinatie van cel labeling door electroporation in ovo, en een latere flat-mount cultuur op de cel cultuur invoegen maakt detectie van migreren cel verkeer en migratie richting. Het doel van deze methode is om de detectie van zowel individuele cel gedrag in de lange termijn en de collectieve actie van een groep cellen in het horizontale vlak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol dat hierboven beschreven is geoptimaliseerd voor het opsporen van cel migratie in de oppervlakkige lagen6,8. Het is van toepassing voor het opsporen van middenlaag migratie streams (film 5)6,7, gewoon door een verschuiving van de timing van de electroporation (E5.5 naar E4.5) en het begin van de cultuur en imaging (E7.0 naar E6.0).
<p class="jove_content…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door JSPS KAKENHI Grant nummer 15K 06740 aan Y.W.
Materials
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
References
- Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
- Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
- Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
- Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
- Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. Developmental Biology. 437, 131-139 (2018).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
