Hierbij presenteren wij een protocol om aan het bed de endotoxine activiteit van menselijke volbloed monsters te meten. De endotoxine activity assay is een eenvoudige test om te presteren en kan een nuttige biomarker zijn bij ernstig zieke patiënten met sepsis.
Lipopolysaccharide, ook bekend als endotoxine, is een fundamenteel bestanddeel van gram-negatieve bacteriën en speelt een cruciale rol in de ontwikkeling van sepsis en septische shock. De vroegtijdige identificatie van een infectieuze proces dat zich snel ontwikkelt tot een kritieke ziekte, kan een snellere en intensievere behandeling mogelijk maken, waardoor dit mogelijk leidt tot betere resultaten van de patiënt. De endotoxine activiteit (EA) test kan aan het bed worden gebruikt als een betrouwbare biomarker van systemische endotoxemie. De detectie van verhoogde endotoxine activiteitsniveaus is herhaaldelijk aangetoond dat deze gepaard gaat met een verhoogde ernst van de ziekte bij patiënten met sepsis en septische shock. De assay is snel en eenvoudig uit te voeren. Kort na de bemonstering wordt een hoeveelheid volbloed gemengd met een anti-endotoxine antilichaam en met toegevoegde LPS. Endotoxine activiteit wordt gemeten als de relatieve oxidatieve uitbarsting van GEPRIMEERDE neutrofielen zoals gedetecteerd door chemioluminescentie. De uitvoer van de assay wordt uitgedrukt op een schaal van 0 (afwezig) tot 1 (maximaal) en gecategoriseerd als “laag” (< 0,4 eenheden), "intermediair" (0,4 – 0.59 eenheden), of "hoog" (≥ 0,6 eenheden). De gedetailleerde methodologie en motivering voor de implementatie van de EA-test worden in dit manuscript gerapporteerd.
De lipopolysaccharide (LPS), ook bekend als endotoxine, is een belangrijk onderdeel van de membraan structuur van gram-negatieve (GN) bacteriën. Het maakt ongeveer 10% van de celwand, essentieel voor de buitenste membraan integriteit en homeostase. Bovendien, het is een krachtige activator van de gastheer aangeboren immuunsysteem1,2.
In vitro blootstelling van aangeboren immuunsysteem cellen aan LPS leidt tot veranderingen in de expressie van meerdere genen3. Toediening van zeer kleine hoeveelheden LPS bij gezonde menselijke vrijwilligers activeert de cascade van acute systemische ontstekingen, terwijl sepsis en septische shock kunnen ontstaan met hogere endotoxine concentraties4,5.
Sepsis is een levensbedreigende aandoening die, indien niet snel herkend, kan leiden tot meervoudig orgaan falen en overlijden. Septische patiënten moeten tijdig worden behandeld, met agressieve reanimatie, adequate antibioticumtherapie, optimale broncode beheersing en snelle orgaanondersteunende strategieën. De diagnose van de etiologie van sepsis is voornamelijk gebaseerd op klinische herkenning en op cultuur gebaseerde pathogeen detectie6. De resultaten van microbiële culturen kunnen echter tot 48 uur duren en zijn onduidelijk in maximaal 30% van de gevallen7. Vroegtijdige identificatie en interventie kunnen leiden tot betere resultaten van de patiënt. Bij patiënten bij wie sepsis wordt vermoed, worden beslissingen vaak genomen op basis van fysiologische en biochemische parameters, zonder een duidelijk teken van endotoxemie.
De meting van de endotoxine activiteit (EA) kan worden verkregen door middel van een commerciële assay (Zie tabel van de materialen) in volbloed. Het kan worden gebruikt als een biomarker van systemische endotoxemie voor de vroege stratificatie van de ernst van de ziekte, met name bij patiënten met een risico op het ontwikkelen van septische shock8. De test werd gebruikt om Polymyxine B hemoperfusie therapie te begeleiden in een recent gepubliceerde dubbelblinde gerandomiseerde-gecontroleerde klinische studie bij patiënten met septische shock9. Bij ernstig zieke patiënten toonde de MEDIC-studie verhoogde EA-niveaus om te worden geassocieerd met meerdere orgaandisfunctie, Intensive Care Unit (ICU) lengte van verblijf, en sterfte10.
Er zijn verschillende assays ontwikkeld om endotoxine op te sporen. De Limulus Amoebocyte lysate (LAL) Assay, hetzij als een gel-stolsel, turbidimetrische, of chromogene test, is tot nu toe het vaakst aangenomen voor de schatting van serum endotoxine. Het is gebaseerd op het vermogen van endotoxine voor het induceren van stolling van de Hemolymfe van de Horseshoe krab, Limulus polyphemus. Deze bepaling heeft echter enkele beperkingen op het gebied van specificiteit. In het bijzonder kan het ook worden geactiveerd door andere microbiële producten dan endotoxine, zoals componenten van de schimmel celwand, en het kan worden geremd door verschillende humane plasmaproteïnen11.
Gedurende het laatste decennium is de meting van EA ontwikkeld en gevalideerd als een biomarker van circulerende endotoxemie. In vergelijking met de LAL test is EA sneller en gemakkelijker te implementeren in de klinische setting. Bovendien, het is aangetoond dat nauwkeuriger dan LAL in volbloed, met verhoogde gevoeligheid en specificiteit, zowel in vitro en in vivo12.
Ondanks de initiële implementatie als een vroeg diagnostisch instrument voor de snelle identificatie van GN-bacteriën als sepsis veroorzaker agenten, is het EA-niveau ook bestudeerd als een biomarker van de ernst van de ziekte. In dit verband is gebleken dat het bijzonder nuttig is om de hypoperfusie toestand te beoordelen als gevolg van aanhoudende kritieke ziekte, zoals septische shock of post-hartstilstand syndroom13. Meer recentelijk, sinds de ontwikkeling van hemopurificatie systemen, is er ook een positief resultaat van EA voorgesteld als screening tool om potentiële kandidaten voor deze therapie14nauwkeurig te identificeren. Onlangs voerden we een observationele retrospectieve studie uit over de prevalentie en klinische significantie van vroege hoge niveaus van EA bij 107 patiënten met septische shock. In lijn met andere recente resultaten ontdekten we dat EA een veelbelovende marker is van de ernst van de ziekte bij patiënten met septische shock15.
Het doel van het huidige manuscript is om de methode te beschrijven om de EA-test uit te voeren, hetzij aan het bed of in het laboratorium, en om het mogelijke gebruik ervan te beschrijven in een representatief scenario van septische shock. Deze techniek kan LPS-activiteit detecteren door het meten van de verbeterde oxidatieve uitbarsting in neutrofielen na hun priming door complexen van een anti-endotoxine-antilichaam en LPS. De verhoogde respiratoire burst wordt gedetecteerd door een chemiluminometer en de hoeveelheid uitgezonden licht wordt evenredig geacht aan de hoeveelheid Endotoxine in het bloedmonster. De assay vereist weinig reagentia, duurt ongeveer 30 minuten om uit te voeren en gebruikt zo weinig als 40 μL volbloed12.
Septische shock is tegenwoordig nog steeds geassocieerd met een sterfte zo hoog als 40%, hoewel dit percentage varieert volgens de overwogen rapporten16. De behoefte aan nieuwe en betere biomerkers wordt bepleit door de meeste deskundigen op de gebieden om clinici te helpen bij vroegtijdige diagnose, beter beheer en prognosticatie van patiënten met septische shock6.
Het uitvoeren van een EA-test vereist geen eerdere technische kennis of geavance…
The authors have nothing to disclose.
We bedanken Paolo Braganò en Lisa Mathiasen, Ph.D. voor hun beoordeling van de methodologie van het assay protocol. Dario winterton, MD heeft substantiële hulp geboden bij het herzien van het manuscript voor Engelse taalvaardigheid.
EAA kit | Spectral Medical Inc. | EAAST-20 | Package with 20 tests + 1 quality control |
Smart Line TL | Berthold | EAASL | Luminometer |
Incubator shaker | GRANT | ES-20 | Mini-incubator shaker |
Vortexer | VWR | 444-2790 | Vortex instrument |