Gelijktijdige studie van de aanwerving van monocyt subpopulaties onder stroom In Vitro
Summary
Hier presenteren we een geïntegreerde protocol die maatregelen monocyt subpopulatie mensenhandel onder stroom in vitro door gebruik van specifieke oppervlakte markers en confocal fluorescentie microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt om te verkennen sequentiële werving stappen ook over andere subtypen van de leukocyten met behulp van andere specifieke oppervlakte markers profile.
Abstract
De aanwerving van monocyten uit het bloed aan gerichte perifere weefsels is kritiek aan het inflammatoire proces tijdens weefsel schade, ontwikkeling van de tumor en auto-immune ziekten. Dit wordt vergemakkelijkt door een proces van vangen van doorstroming op het luminal oppervlak van geactiveerde endotheliale cellen, gevolgd door hun migratie hechting en signaalcomplexen (zielsverhuizing) in het onderliggende aangetast weefsel. De mechanismen die ondersteuning bieden voor de preferentiële en context-afhankelijke werving van monocyt subpopulaties worden echter nog steeds niet volledig begrepen. Daarom hebben wij een methode waarmee de aanwerving van verschillende monocyt subpopulaties gelijktijdig worden gevisualiseerd en gemeten onder stroom ontwikkeld. Deze methode, gebaseerd op time-lapse confocal imaging, voorziet het duidelijke onderscheid tussen aanhangend en transmigrated monocyten. Hier beschrijven we hoe deze methode kan worden gebruikt om gelijktijdig de opeenvolging van de werving van pro-angiogenic en niet-angiogenic monocyten in vitro studie. Bovendien, deze methode kan worden uitgebreid om te bestuderen van de verschillende stappen van de aanwerving van maximaal drie monocyt populaties.
Introduction
Monocyten een fagocytische onderdeel vormen van aangeboren immuniteit dat essentieel is voor de bestrijding van ziekteverwekkers, opruimen van beschadigde weefsels, angiogenese en de pathofysiologie van vele ziekten, waaronder kanker1,2,3 . Monocyten zijn beenmerg-afgeleide cellen samengesteld van heterogene subpopulaties die circuleren in het bloed, maar op de site van ontsteking in perifeer weefsel kunnen worden aangeworven door middel van specifieke moleculaire mechanismen. De aanwerving cascades van monocyten, wat betreft de leukocyten in het algemeen impliceert verschillende stappen waaronder vangen, rollen, kruipen, arrestatie, migratie van signaalcomplexen (zielsverhuizing) en migratie door de vaatwand (kelder membraan en muurschildering cellen)4. Deze maatregelen betreffen voornamelijk ontsteking geïnduceerde moleculen op het endotheel luminal oppervlak zoals selectinen, glycoproteïne liganden chemokines, intercellulaire en regulates celadhesie-moleculen en hun receptoren op leukocyten zoals selectine liganden en integrins. Mensenhandel trajecten via ofwel de endothelial cel kruispunten (paracellular) of via de endothelial cel lichaam (transcellulair) kunnen worden gebruikt door leukocyten te steken van het endotheel barrière-5. Terwijl monocyten zijn historisch gedocumenteerd te transmigrate door de transcellulair-route, hebben mogelijke verschillen in hun trekkende traject voorgesteld als monocyten zijn niet langer beschouwd als een homogene-celpopulatie. Het is nu duidelijk dat monocyt diversiteit kan worden gedefinieerd door elk van hun verschillen en overeenkomsten, met betrekking tot hun kenmerkende extravasation cascades3,6. Daarom, teneinde ondubbelzinnig onderscheid te maken tussen monocyt subpopulaties, is het van cruciaal belang om te visualiseren en fenotype het gedrag van elk van deze verschillende subpopulaties tijdens de aanwerving verwerken.
Monocyten van menselijke, pig, rat en muis waren onderverdeeld in fenotypische subpopulaties met bepaalde waaraan functies en specifieke trekkende gedrag7,8,9. Bijvoorbeeld, bij de mens, kunnen monocyten worden onderverdeeld in drie subgroepen op basis van hun oppervlakte uitdrukking van CD14, een co-receptor voor bacteriële lipopolysaccharide en CD16, de Fc-gamma receptor III. Menselijke monocyt subpopulaties omvatten klassieke CD14+CD16–, middenniveau CD14+CD16+ en niet-klassieke CD14dimCD16+ 6,9cellen. De klassieke CD14+CD16– monocyten bleken te zijn voornamelijk inflammatoire overwegende dat de pool van CD16+ monocyten bleken collectief te presenteren TIE2 meningsuiting en proangiogenic functie10. Consequent, endothelial cel stimulatie met inflammatoire cytokines zoals menselijke tumor necrose factor (TNF) α of Interleukine (IL-1) beta (conventionele ontsteking) is voldoende om te leiden tot de volledige aanwerving van klassieke CD14+CD16 – de monocyten. Gelijktijdige acties van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) A en TNFα (angiogenic factoren gestuurde ontsteking) zijn echter vereist om te provoceren de transmigratie van de CD16+ proangiogenic pool van monocyten3. In het verleden het traditionele systeem van de Transwell onder statische omstandigheden, de parallelle plaat stroom zaal en de µ-dia stroom kamers zijn gebruikt om het kwantitatief analyseren de aanwerving van een leukocyte bevolking op een tijd in vitro11 ,12,13. Terwijl deze protocollen zijn gevalideerd, een meer robuuste methode waardoor de gelijktijdige analyse van meerdere monocyt subpopulaties zou worden beschouwd als meer inzicht. Dergelijke methodologieën moeten rekening voor meerdere interacties en de verschillende frequenties van elke respectieve bevolking en bieden ook een mechanistische inzicht in de gelijkenissen en de specifieke kenmerken voor de aanwerving cascades die elke monocyt bepalen subset.
Hier presenteren we een methode gebaseerd op de time-lapse beeldvorming van monocyt recruitment onder stroom waarmee de trekkende cascades van verschillende monocyt subpopulaties gelijktijdig worden bestudeerd met behulp van de confocal microscopie. Deze methode integreert bepaalde kritische features die endothelial cel ontsteking, evenals de hemodynamica van circulerende monocyten in post capillaire venules, de hoofdlocatie van leukocyten aanwerving in vivo na te bootsen. De voorgestelde methode maakt gebruik van menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVEC), die worden gegenereerd door een goed gangbaar protocol van isolatie van menselijke umbilical koorden. Deze klinische resource heeft het voordeel dat ze gemakkelijk beschikbaar als biologische bijproduct, terwijl ook het verstrekken van een redelijk rendement van endotheliale cellen die geïsoleerd uit de navelstreng ader worden kunnen. Wij ook gebruikt fluorescente kleurstoffen en immunofluorescentie onderscheid maken tussen de verschillende cellulaire componenten, en confocale microscopie ondubbelzinnig definiëren monocyt positionering (luminal vs. abluminal) na verloop van tijd. Het hier gepresenteerde protocol heeft ontwikkeld om tegelijkertijd maatregel de zielsverhuizing niveaus van monocyt subpopulaties. Bovendien moet worden opgemerkt dat deze methode kan worden uitgebreid om te bestuderen van andere leukocyten subpopulaties en recruitment processen door gebruik van verschillende biomerkers en etikettering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wij rapporteren hier, een methode die een studie van hoe monocyt subpopulaties via de ontstoken endothelial enkelgelaagde transmigrate detaillering. De besproken methode gebruikt confocale microscopie in plaats van fase contrast microscopie, die ook wordt gebruikt om te studeren monocyt recruitment onder stroom3,11,19. Een groot voordeel van het gebruik van de confocal microscopie voor time-lapse beeldvorming is de mogelijkheid …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Paul Bradfield voor manuscript lezen en feedback. A. S. kreeg financiële steun van de Sir Jules Thorn charitatieve overzeese vertrouwen Reg.,
Materials
| Tissue Culture Flasks 75 cm2 | TPP | 90076 | Routine culture of isolated HUVEC |
| µ-Slide VI 0.4 | IBIDI | 80606 | |
| Centrifuge Tubes 15 mL | TPP | 191015 | |
| Centrifuge Tubes 50 mL | TPP | 191050 | |
| Collagen G | Biochrom | L 7213 | For coating of cell culture flasks |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | 1393 | For coating of cell culture flasks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 3-Way Stopcocks | BIO-RAD | 7328103 | |
| penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml | AMIMED | 4-02F00-H | |
| Collagenase type 1 | Worthington | LS004216 | |
| Medium 199 1X avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes | GIBCO | 22340020 | |
| Bovine Albumin Fraction V | ThermoFisher | 15260037 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg | Millipore | 02-102 | |
| Heparin Sodium | Sigma-Aldrich | H3149RT | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H6909 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A 4544 | |
| EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O | APPLICHEM | A2937.0500 | |
| CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC | Miltenyi Biotech | 130-100-713 | AB_2655150 |
| CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-807 | AB_2657280 |
| Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC | Miltenyi Biotech | 130-107-016 | AB_2653263 |
| BD Accuri C6 Plus | BD Bioscience | ||
| µ-Slide I Luer | IBIDI | 80176 | |
| CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | ThermoFisher | C2925 | |
| Recombinant human TNFα | Peprotech | 300-01A | |
| Recombinant human VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
| NE-1000 Programmable Syringe Pump | KF Technology | NE-1000 | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-519 | AB_2655051 |
| Pan Monocyte Isolation Kit, human | Miltenyi Biotech | 130-096-537 | |
| Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE | Miltenyi Biotech | 130-106-762 | AB_2655403 |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | ThermoFisher | H1399 | |
| Silicone tubing | IBIDI | 10841 | |
| Elbow Luer Connector | IBIDI | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | IBIDI | 10823 | |
| Luer Lock Connector Female | IBIDI | 10825 | |
| In-line Luer Injection Port | IBIDI | 10820 | |
| Ar1 confocal microscope | Nikon | ||
| 40X objective | Nikon | 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm | |
| ImageJ Software | NIH |
References
- Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).
- De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).
- Sidibe, A., et al. Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours. Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).
- Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).
- Chamorro, S., et al. In vitro differentiation of porcine blood CD163− and CD163+ monocytes into functional dendritic cells. Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).
- Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood. Blood. 74 (7), (1989).
- Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
- Bradfield, P. F., et al. JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation. Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).
- Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation. Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).
- Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha. Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).
- ibidi GmbH. . Shear Stress and Shear Rates for ibidi µ-Slides – Based on Numerical Calculations. , (2014).
- Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Yang, C. -. R., Hsieh, S. -. L., Ho, F. -. M., Lin, W. -. W. Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression. Journal of Immunology. 174 (3), 1647-1656 (2005).
- Wong, D., Dorovini-Zis, K. Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture. Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).
- Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
- Bradfield, P. F., et al. Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques. PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).
