الدراسة المتزامنة لتجنيد الوحيدات الفئات السكانية الفرعية تحت التدفق في الأنابيب
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا متكاملة أن تدابير الوحيدات يتدنى الاتجار تحت التدفق في المختبر باستخدام علامات محددة السطحية والأسفار [كنفوكل] مجهرية. يمكن استخدام هذا البروتوكول لاستكشاف خطوات التوظيف متتابعة، وكذلك فيما يتعلق بالشخصية الأخرى فرعية الكريات البيض باستخدام علامات السطحية محددة أخرى.
Abstract
تجنيد وحيدات من الدم إلى الأنسجة المحيطة المستهدفة حاسمة بالنسبة لعملية تحريضية أثناء إصابة نسيج والتنمية الأورام وأمراض المناعة الذاتية. هذا هو سهل من خلال عملية القبض من التدفق الحر على سطح لومينال لتنشيط خلايا بطانية، تليها هجرتها الالتصاق وترانسيندوثيليال (التهجير) في الأنسجة المتضررة الأساسية. ومع ذلك، الآليات التي تدعم توظيف الفئات السكانية الفرعية الوحيدات تفضيلية وتعتمد على السياق، هي لا تزال غير مفهومة تماما. ولذلك، قمنا بتطوير أسلوب التي تسمح بتجنيد الوحيدات مختلف الفئات السكانية الفرعية في نفس الوقت تصور وقياسها تحت التدفق. يسمح هذا الأسلوب، استناداً إلى الوقت الفاصل بين التصوير [كنفوكل]، لأن التمييز لا لبس فيه بين وحيدات ملتصقة وترانسميجراتيد. وهنا يصف لنا كيف يمكن استخدام هذا الأسلوب لدراسة سلسلة تجنيد وحيدات برو-الأوعية وغير الأوعية في المختبر في نفس الوقت. وعلاوة على ذلك، يمكن توسيع هذا الأسلوب لدراسة الخطوات المختلفة للتوظيف لتصل إلى الثلاث الوحيدات السكان.
Introduction
وحيدات تشكل عنصرا متجولة من الحصانة الفطرية التي لا غنى عنها لمكافحة ناقلات الأمراض، تنظيف الأنسجة التالفة، والأوعية، والفسيولوجيا المرضية للعديد من الأمراض بما فيها السرطان1،2،3 . هي وحيدات الخلايا المشتقة من نخاع العظم وتتألف من الفئات السكانية الفرعية غير المتجانسة التي تعمم في الدم ولكن يمكن تعيين إلى الموقع التهاب في الأنسجة المحيطية من خلال الآليات الجزيئية المحددة. وبصفة عامة، تورط الشلالات التوظيف من وحيدات، أما بالنسبة للكريات البيضاء خطوات مختلفة بما في ذلك التقاط، المتداول، والزحف، والاعتقال والهجرة ترانسيندوثيليال (التهجير) والهجرة من خلال جدار الوعاء (الغشاء ولوحة جدارية 4من الخلايا). هذه الخطوات تشمل أساسا الجزيئات الناجمة عن الالتهابات على سطح غشائي لومينال مثل سيليكتينس وبروتين سكري يغاندس، المستقطبات، وجزيئات الالتصاق بين الخلايا وهالة وعلى مستقبلات في الكريات البيضاء مثل سيليكتين يغاندس وإينتيجرينس. مسارات الاتجار أما الوصلات الخلية البطانية (باراسيلولار) أو من خلال هيئة الخلية البطانية (ترانسسيلولار) يمكن أن يستخدمها الكريات البيضاء لعبور حاجز غشائي5. بينما وحيدات وثقت تاريخيا ترانسميجراتي طريق ترانسسيلولار، وقد اقترحت الاختلافات المحتملة في مسار الهجرة على كما لم تعد تعتبر وحيدات خلية متجانسة سكان. الآن أصبح من الواضح أن التنوع الوحيدات يمكن تعريفها بواسطة كل من خلافاتها والقواسم المشتركة، وفيما يتعلق التسرب المميزة الشلالات3،6. ولذلك، كي لا لبس فيه تميز بين الفئات السكانية الفرعية الوحيدات، من الأهمية بمكان لتصور والنمط الظاهري سلوك كل من هذه الفئات السكانية الفرعية المختلفة أثناء التعيين عملية.
وحيدات من البشرية، والخنازير والجرذان والفأر كانت ينقسم إلى الفئات السكانية الفرعية المظهرية مع بعض المهام المنسوبة وسلوكيات محددة المهاجرة7،،من89. على سبيل المثال، في البشر، يمكن تقسيم وحيدات إلى ثلاث مجموعات فرعية استناداً إلى التعبير عنها السطحية CD14، التمييز عن lipopolysaccharide البكتيرية، و CD16، مستقبلات Fc-غاما الثالث. وتشمل الفئات السكانية الفرعية الوحيدات البشرية CD14 الكلاسيكية+CD16–، وسيطة CD14+CD16+ وغير الكلاسيكية CD14خافتCD16 الخلايا+ 6،9. CD14 الكلاسيكية+CD16 وحيدات– وعرضت أن تكون أساسا التحريضية في حين تجمع CD16+ وحيدات عثر جماعياً لتقديم TIE2 التعبير وبروانجيوجينيك الدالة10. دأبت، عامل تحفيز الخلية البطانية مع السيتوكينات الالتهابية مثل نخر الورم البشري α (تنف) أو انترلوكين (IL-1) بيتا (التهاب التقليدية) غير كافية لتشغيل كاملة تجنيد CD14 الكلاسيكية+CD16 – وحيدات. بيد الإجراءات المتزامنة بعامل نمو الأوعية الدموية غشائي (VEGF) و TNFα (التهاب الأوعية تحركها عوامل) مطلوبة لإثارة التهجير CD16+ تجمع بروانجيوجينيك وحيدات3. تاريخيا، استخدمت النظام التقليدي ترانسويل تحت ظروف ثابتة، وغرفة تدفق صفيحة متوازية، والدوائر تدفق μ-الشريحة لتحليل كمي تجنيد السكان الكريات البيض واحد وقت في المختبر11 ،،من1213. في حين قد تم التحقق من صحة هذه البروتوكولات، سينظر أسلوب أكثر قوة أن يسمح تحليل الفئات السكانية الفرعية الوحيدات متعددة متزامنة أكثر الثاقبة. يجب مراعاة التفاعلات متعددة وترددات مختلفة لكل سكان كل منها هذه المنهجيات وأيضا توفير فهم ميكانيكية لأوجه التشابه والخصوصيات للشلالات التجنيد التي تقوم بتعريف كل الوحيدات مجموعة فرعية.
نقدم هنا، أسلوب يقوم على تصوير الوقت الفاصل بين تجنيد الوحيدات تحت التدفق الذي يسمح الشلالات الكثيرة الارتحال من الوحيدات مختلف الفئات السكانية الفرعية دراستها في نفس الوقت باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]. ويدمج هذا الأسلوب بعض الميزات الهامة التي تحاكي التهاب غشائي الخلايا، فضلا عن الهليوكبتر تعميم وحيدات في الأوردة الشعرية اللاحقة، المقر الرئيسي للتوظيف الكريات البيض في الحية. يستخدم الأسلوب المقترح الخلايا البطانية البشرية الوريد السري (هوفيك)، التي يتم إنشاؤها من خلال بروتوكول راسخة في معزل عن البشرية السرة الحبال. هذا المورد السريرية لديه ميزة كونها متاحة بسهولة كمنتج ثانوي بيولوجية، بينما أيضا توفير عائد معقول من الخلايا البطانية التي يمكن أن تكون معزولة من الوريد السري. كنا أيضا الأصباغ الفلورية والفلوره للتمييز بين مختلف مكونات الخلوية، والفحص المجهري [كنفوكل] لتعريف لا لبس فيه الوحيدات لتحديد المواقع (لومينال مقابل أبلومينال) مع مرور الوقت. وقد وضع بروتوكول المقدمة هنا للتدبير في نفس الوقت مستويات الهجرة من الفئات السكانية الفرعية الوحيدات. وعلاوة على ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه يمكن تمديد هذه المنهجية لدراسة الفئات السكانية الفرعية الكريات البيضاء وعمليات التوظيف الأخرى باستخدام المؤشرات الحيوية المختلفة ووضع العلامات.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن تقرير أسلوب التفصيل دراسة كيف ترانسميجراتي الوحيدات الفئات السكانية الفرعية من خلال المونولاير بطانية ملتهبة. ويستخدم أسلوب بحث مجهرية [كنفوكل] بدلاً من الفحص المجهري المرحلة عالي التباين، الذي يستخدم أيضا لدراسة تجنيد الوحيدات تحت تدفق3،،من11…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الدكتور بول برادفيلد لقراءة المخطوط والتغذية المرتدة. أ. س. تلقت دعما ماليا من “السير جول شوكة الخيرية الأجنبية الثقة reg.”،
Materials
| Tissue Culture Flasks 75 cm2 | TPP | 90076 | Routine culture of isolated HUVEC |
| µ-Slide VI 0.4 | IBIDI | 80606 | |
| Centrifuge Tubes 15 mL | TPP | 191015 | |
| Centrifuge Tubes 50 mL | TPP | 191050 | |
| Collagen G | Biochrom | L 7213 | For coating of cell culture flasks |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | 1393 | For coating of cell culture flasks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 3-Way Stopcocks | BIO-RAD | 7328103 | |
| penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml | AMIMED | 4-02F00-H | |
| Collagenase type 1 | Worthington | LS004216 | |
| Medium 199 1X avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes | GIBCO | 22340020 | |
| Bovine Albumin Fraction V | ThermoFisher | 15260037 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg | Millipore | 02-102 | |
| Heparin Sodium | Sigma-Aldrich | H3149RT | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H6909 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A 4544 | |
| EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O | APPLICHEM | A2937.0500 | |
| CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC | Miltenyi Biotech | 130-100-713 | AB_2655150 |
| CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-807 | AB_2657280 |
| Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC | Miltenyi Biotech | 130-107-016 | AB_2653263 |
| BD Accuri C6 Plus | BD Bioscience | ||
| µ-Slide I Luer | IBIDI | 80176 | |
| CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | ThermoFisher | C2925 | |
| Recombinant human TNFα | Peprotech | 300-01A | |
| Recombinant human VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
| NE-1000 Programmable Syringe Pump | KF Technology | NE-1000 | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-519 | AB_2655051 |
| Pan Monocyte Isolation Kit, human | Miltenyi Biotech | 130-096-537 | |
| Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE | Miltenyi Biotech | 130-106-762 | AB_2655403 |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | ThermoFisher | H1399 | |
| Silicone tubing | IBIDI | 10841 | |
| Elbow Luer Connector | IBIDI | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | IBIDI | 10823 | |
| Luer Lock Connector Female | IBIDI | 10825 | |
| In-line Luer Injection Port | IBIDI | 10820 | |
| Ar1 confocal microscope | Nikon | ||
| 40X objective | Nikon | 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm | |
| ImageJ Software | NIH |
References
- Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).
- De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).
- Sidibe, A., et al. Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours. Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).
- Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).
- Chamorro, S., et al. In vitro differentiation of porcine blood CD163− and CD163+ monocytes into functional dendritic cells. Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).
- Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood. Blood. 74 (7), (1989).
- Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
- Bradfield, P. F., et al. JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation. Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).
- Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation. Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).
- Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha. Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).
- ibidi GmbH. . Shear Stress and Shear Rates for ibidi µ-Slides – Based on Numerical Calculations. , (2014).
- Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Yang, C. -. R., Hsieh, S. -. L., Ho, F. -. M., Lin, W. -. W. Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression. Journal of Immunology. 174 (3), 1647-1656 (2005).
- Wong, D., Dorovini-Zis, K. Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture. Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).
- Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
- Bradfield, P. F., et al. Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques. PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).
