מחקר בו זמנית של הגיוס של מונוציט Subpopulations תחת זרימה במבחנה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול משולב המודד מונוציט subpopulation סחר תחת זרימה במבחנה באמצעות סמני פני שטח מסוים, מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור את השלבים רציפים גיוס גם לגבי פרופיל אחרים יחוברו ליקוציט באמצעות סמנים אחרים משטח מסוים.
Abstract
הגיוס של monocytes מהדם לרקמות היקפיים יישוב הינה קריטית תהליך דלקתי במהלך פגיעה ברקמות, התפתחות גידולים ומחלות אוטואימוניות. זה נהיה בתהליך של לכידת זרימה חופשית על גבי המשטח luminal של תאי אנדותל מופעל, ואחריו להגירתם אדהזיה ו- transendothelial (גלגול) לתוך הרקמה הבסיסית המושפעת. עם זאת, המנגנון תומכים בגיוס מועדף, תלויי-ההקשר מונוציט subpopulations עדיין לא לגמרי מובנים. לכן, פיתחנו שיטה המאפשרת הגיוס של subpopulations מונוציט שונים בו זמנית מדמיין, שנמדד תחת זרימה. שיטה זו, המבוססת על הדמיה קונאפוקלית זמן לשגות, מאפשר ההבחנה ברורה וחד משמעית בין חסיד, שמדמו ומונוציטים. כאן, אנו נתאר כיצד ניתן להשתמש בשיטה זו ללמוד בו זמנית את המפל גיוס של pro-אנגיוגנזה, הלא-אנגיוגנזה ומונוציטים במבחנה. יתר על כן, שיטה זו ניתן להרחיב ללמוד את שלבי הגיוס של עד שלוש אוכלוסיות מונוציט שונים.
Introduction
ומונוציטים מהווים מרכיב phagocytic של מולדת חסינות זה חיוני בלחימה פתוגנים, מנקה את רקמות שנפגעו אנגיוגנזה, הפתופיזיולוגיה של מחלות רבות, כולל סרטן1,2,3 . ומונוציטים הם תאים הנגזרות מח העצם מורכב subpopulations הטרוגנית במחזור הדם, אבל יכול להיות גויסו לאתר של דלקת ברקמות היקפיים באמצעות מנגנונים מולקולריים ספציפיים. למפל גיוס של monocytes, באשר לויקוציטים מרמז באופן כללי, שלבים שונים כולל לכידת, גלגול, זחילה, מעצר, transendothelial ההעברה (גלגול) העברה דרך הקיר כלי (קרום המרתף, ציור קיר תאים)4. שלבים אלה כוללות בעיקר דלקת-induced מולקולות על פני אנדותל luminal כגון selectins, ליגנדים גליקופרוטאין, נוגדנים, מולקולות אדהזיה המערכת, מהחיבור שלהם רצפטורים על לויקוציטים כגון בחירת שמלות ליגנדים אינטגרינים. סחר מסלולים דרך גם את תאי אנדותל צמתים (paracellular) או דרך הגוף תא אנדותל (transcellular) ניתן על ידי לויקוציטים לחצות את המכשול אנדותל5. בעוד ומונוציטים היסטורית תועדו כדי transmigrate דרך המסלול transcellular, פערים פוטנציאליים במסלול הנדידה שלהם הוצעו כפי ומונוציטים כבר לא נחשבים אוכלוסיה הומוגנית התא. עכשיו כעת ברור כי גיוון מונוציט יכולה להיות מוגדרת על ידי כל אחד של ההבדלים שלהם מכנה משותף, ביחס extravasation הייחודי שלהם מפלי3,6. לכן, על מנת חד משמעית מתלבטים מונוציט subpopulations, זה חיוני כדי להמחיש ולעבד פנוטיפ ההתנהגות של כל אלה subpopulations שונים במהלך הגיוס.
ומונוציטים מן האדם, חזיר, החולדה, העכבר היו המתפרשות לתוך subpopulations פנוטיפי עם פונקציות ייחסה של התנהגויות ספציפיות נודדות-7,–8,–9מסוימים. לדוגמה, בבני אדם, ומונוציטים ניתן לחלק שלוש קבוצות משנה המבוסס על שלהם ביטוי פני השטח של CD14, coreceptor עבור ליפופוליסכריד חיידקי, CD16, הקולטן Fc-גמא השלישי. מונוציט האנושי subpopulations כוללים CD14 קלאסית+CD16–, ביניים CD14+CD16+ וקלאסי CD14עמוםCD16+ תאים6,9. CD14 הקלאסית+CD16– ומונוציטים הוכחו להיות בעיקר דלקתיות ואילו הבריכה של CD16+ ומונוציטים נמצאו באופן קולקטיבי להציג TIE2 proangiogenic וביטוי פונקציה10. באופן עקבי, תאי אנדותל גירוי עם ציטוקינים דלקתיים כגון גידול אנושי נמק פקטור (TNF) α או אינטרלוקין (IL-1) בטא (דלקת קונבנציונלי) מספיקה לעורר גיוס מלא של קלאסית CD14+CD16 – ומונוציטים. לעומת זאת, נדרשות פעולות בו-זמניות של כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF) A ו TNFα (דלקת מונחה גורמי אנגיוגנזה) לעורר גלגול של CD16+ proangiogenic בריכה של monocytes3. מבחינה היסטורית, שימשו את המערכת Transwell המסורתית תחת תנאים סטטיים תא זרימה לוחית מקבילים, התאים זרימה ממוצע שקופית לנתח באופן כמותי את גיוס ליקוציט אחד האוכלוסייה בגיל זמן במבחנה11 12, ,13. בעוד יש פרוטוקולים אלה מאומתים, שיטה עמידים יותר כי מותר ניתוח בו זמנית של מספר מונוציט subpopulations ייחשב נבונה יותר. מתודולוגיות כזה חייב חשבון עבור אינטראקציות מרובות, התדרים שונות של כל האוכלוסייה בהתאמה ולספק גם הבנה מכניסטית של דמיון ושל specificities למפל גיוס המגדירים כל מונוציט משנה.
כאן, אנו מציגים שיטה המבוססת על ההדמיה בצילום מואץ של הגיוס מונוציט תחת זרימה אשר מאפשר את מפלי נודדות מונוציט שונים subpopulations שילמדו בו זמנית על-ידי שימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו משלבת תכונות מסוימות קריטיות לחקות דלקת תא אנדותל, כמו גם את ספיקת הדם של מחזורי ומונוציטים ב venules נימי פוסט, המיקום המרכזי של גיוס ליקוציט ויוו. השיטה המוצעת משתמשת יפתור אנדותל תאים (HUVEC), אשר נוצרות באמצעות פרוטוקול ומבוססת של בידוד מן האדם חוטי חבל הטבור. משאב קליני זה יש את היתרון של להיות זמין בקלות היא מוצר לוואי ביולוגיות, בעוד גם מתן תשואה סבירה של תאי אנדותל שניתן שבודד וריד הטבור. השתמשנו גם צבעי פלורסנט, immunofluorescence להבחין בין מרכיבי התא השונים, מיקרוסקופיה קונפוקלית חד משמעית להגדיר מונוציט מיצוב (luminal לעומת abluminal) לאורך זמן. פרוטוקול המובאת כאן פותחה כדי למדוד בו זמנית את רמות גלגול מונוציט subpopulations. יתר על כן, יש לציין כי מתודולוגיה זו ניתן להרחיב את לימוד אחרים לויקוציטים subpopulations, תהליכי גיוס על ידי שימוש סמנים ביולוגיים שונים וסימון.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מדווחים על שיטה המפרט מחקר של מה מונוציט subpopulations transmigrate דרך טפט אנדותל מודלק. השיטה דנו להשתמש מיקרוסקופיה קונפוקלית במקום שלב-ניגודיות מיקרוסקופ, אשר משמש גם ללמוד מונוציט גיוס תחת זרימה3,11,19. אחד היתרונות של שימוש מיקרוסקופיה ק?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד ר פול Bradfield על כתב היד הקריאה ואת המשוב. א ס קיבלו תמיכה כספית מארגון אדוני ג’ולס ת’ורן צדקה בחו ל לבטוח רג,
Materials
| Tissue Culture Flasks 75 cm2 | TPP | 90076 | Routine culture of isolated HUVEC |
| µ-Slide VI 0.4 | IBIDI | 80606 | |
| Centrifuge Tubes 15 mL | TPP | 191015 | |
| Centrifuge Tubes 50 mL | TPP | 191050 | |
| Collagen G | Biochrom | L 7213 | For coating of cell culture flasks |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | 1393 | For coating of cell culture flasks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 3-Way Stopcocks | BIO-RAD | 7328103 | |
| penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml | AMIMED | 4-02F00-H | |
| Collagenase type 1 | Worthington | LS004216 | |
| Medium 199 1X avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes | GIBCO | 22340020 | |
| Bovine Albumin Fraction V | ThermoFisher | 15260037 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg | Millipore | 02-102 | |
| Heparin Sodium | Sigma-Aldrich | H3149RT | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H6909 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A 4544 | |
| EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O | APPLICHEM | A2937.0500 | |
| CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC | Miltenyi Biotech | 130-100-713 | AB_2655150 |
| CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-807 | AB_2657280 |
| Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC | Miltenyi Biotech | 130-107-016 | AB_2653263 |
| BD Accuri C6 Plus | BD Bioscience | ||
| µ-Slide I Luer | IBIDI | 80176 | |
| CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | ThermoFisher | C2925 | |
| Recombinant human TNFα | Peprotech | 300-01A | |
| Recombinant human VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
| NE-1000 Programmable Syringe Pump | KF Technology | NE-1000 | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-519 | AB_2655051 |
| Pan Monocyte Isolation Kit, human | Miltenyi Biotech | 130-096-537 | |
| Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE | Miltenyi Biotech | 130-106-762 | AB_2655403 |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | ThermoFisher | H1399 | |
| Silicone tubing | IBIDI | 10841 | |
| Elbow Luer Connector | IBIDI | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | IBIDI | 10823 | |
| Luer Lock Connector Female | IBIDI | 10825 | |
| In-line Luer Injection Port | IBIDI | 10820 | |
| Ar1 confocal microscope | Nikon | ||
| 40X objective | Nikon | 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm | |
| ImageJ Software | NIH |
References
- Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).
- De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).
- Sidibe, A., et al. Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours. Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).
- Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).
- Chamorro, S., et al. In vitro differentiation of porcine blood CD163− and CD163+ monocytes into functional dendritic cells. Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).
- Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood. Blood. 74 (7), (1989).
- Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
- Bradfield, P. F., et al. JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation. Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).
- Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation. Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).
- Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha. Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).
- ibidi GmbH. . Shear Stress and Shear Rates for ibidi µ-Slides – Based on Numerical Calculations. , (2014).
- Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Yang, C. -. R., Hsieh, S. -. L., Ho, F. -. M., Lin, W. -. W. Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression. Journal of Immunology. 174 (3), 1647-1656 (2005).
- Wong, D., Dorovini-Zis, K. Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture. Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).
- Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
- Bradfield, P. F., et al. Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques. PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).
