Samtidige studie av rekrutteringen av Monocyte subpopulasjoner Under flyt In Vitro

Summary

Her presenterer vi en integrert protokoll som måler monocytt subpopulasjon smugling under flyt i vitro ved bruk av bestemte overflate markører og AC confocal fluorescens mikroskopi. Denne protokollen kan brukes å utforske sekvensiell rekruttering trinn også om profil andre leukocytter subtyper med andre spesifikke overflate markører.

Abstract

Rekruttering av monocytter fra blodet til målrettet perifere vev er avgjørende for inflammatorisk prosessen under tissue skade, tumor utvikling og autoimmune sykdommer. Dette er tilrettelagt gjennom en fange fra fri flyt på luminal overflaten av aktivert endotelceller, etterfulgt av folkevandring vedheft og transendothelial (transmigration) i det underliggende berørte vev. Men er mekanismer som støtter fortrinnsrett og kontekst-avhengige rekruttering av monocyte subpopulasjoner fortsatt ikke fullt ut forstått. Derfor har vi utviklet en metode der rekruttering av ulike monocytt subpopulasjoner samtidig visualisert og målt under flyt. Denne metoden, basert på tidsinnstilt AC confocal bildebehandling, gjør entydig skillet mellom tilhenger og transmigrated monocytter. Her beskriver vi hvordan denne metoden kan brukes samtidig studere rekruttering kaskade av pro-angiogenic og ikke-angiogenic monocytter i vitro. Denne metoden kan videre utvides for å studere de ulike trinnene i rekrutteringen av opptil tre monocytt populasjoner.

Introduction

Monocytter utgjør en phagocytic komponent i medfødt immunitet som er nødvendig for å bekjempe patogener, rydde opp skadet vev og angiogenese i Patofysiologien ved mange sykdommer, inkludert kreft^1,2,3 . Monocytter er Ben margtransplantasjon-avledet celler består av heterogene subpopulasjoner som sirkulerer i blodet, men kan bli rekruttert til området av betennelse i perifere vev gjennom bestemte molekylære mekanismer. Rekruttering kaskader av monocytter, som leukocytter, impliserer fremgangsmåten inkludert fange, rullende, krypende, arrestasjon, transendothelial overføring (transmigration) og overføring gjennom fartøyet veggen (kjelleren membran og veggmaleri celler)⁴. Disse trinnene omfatter hovedsakelig betennelse-indusert molekyler på endothelial luminal overflaten som selectins, glykoprotein ligander, chemokines, junctional og intercellulær adhesjon molekyler og deres reseptorer på leukocytter som selectin ligander og integrins. Menneskehandel veier gjennom enten endothelial celle veikryss (paracellular) eller via endothelial celle kroppen (transcellular) kan brukes av leukocytter for å krysse endothelial barriere⁵. Mens monocytter historisk dokumentert for å transmigrate gjennom transcellular ruten, er potensielle forskjeller i deres vandrende veien foreslått som monocytter er ikke lenger ansett som en homogen celle befolkningen. Nå blir det klart at monocytt mangfold kan defineres av hver av sine fellestrekk og ulikheter, med hensyn til deres karakteristiske bloduttredelse kaskader^3,6. Derfor for å entydig forskjellsbehandle monocytt subpopulasjoner, er det avgjørende å visualisere og fenotypen virkemåten til hver av disse forskjellige subpopulasjoner under rekruttering behandle.

Monocytter fra menneske, gris, rotte og mus var inndelt i fenotypiske subpopulasjoner med visse tilskrives funksjoner og spesifikk vandrende atferd^7,8,9. For eksempel i mennesker, kan monocytter deles inn i tre undergrupper basert på deres overflate gjengivelsen av CD14, en coreceptor for bakteriell lipopolysakkarid, og CD16, Fc-gamma reseptoren III. Menneskelige monocytt subpopulasjoner inkluderer klassisk CD14⁺CD16^–, middels CD14⁺CD16⁺ og ikke-klassiske CD14^dimCD16⁺ celler^6,9. Den klassiske CD14⁺CD16^– monocytter ble vist å være hovedsakelig inflammatorisk mens utvalget av CD16⁺ monocytter fant kollektivt for å presentere TIE2 uttrykk og proangiogenic funksjonen¹⁰. Konsekvent endothelial celle stimulering med inflammatoriske cytokiner som menneskelige tumor nekrose faktor (TNF) α eller interleukin (IL-1) beta (konvensjonelle betennelse) er tilstrekkelig til å utløse komplett rekruttering av klassisk CD14⁺CD16 ^– reaksjoner. Men samtidig handlinger av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) A og TNFα (angiogenic faktorer-drevet betennelse) er påkrevd å provosere transmigration av CD16⁺ proangiogenic pool av monocytter³. Historisk, tradisjonell Transwell systemet under statisk forhold, parallelle plate flow chamber og μ-slide flyt kamrene har blitt brukt kvantitativt analysere rekruttering av en leukocytter befolkningen på en gang i vitro^{11 ,12,13}. Mens disse protokollene har validert, betraktes en mer robust metode som tillater samtidig analyse av flere monocytt subpopulasjoner mer innsiktsfulle. Slike metoder må konto for flere interaksjoner og ulike frekvenser av hver respektive befolkningen og også gi en mekanistisk forståelse av likheter og særegenheter for rekruttering kaskader som definerer hver monocytt delsett.

Her presenterer vi en metode basert på time-lapse avbilding av monocyte rekruttering under flyt som lar den vandrende kaskader av ulike monocytt subpopulasjoner studier samtidig ved hjelp av AC confocal mikroskopi. Denne metoden integrerer visse kritiske funksjoner som etterligner endothelial celle betennelse, samt hemodynamics i sirkulerende monocytter i post kapillært venules, viktigste plasseringen av leukocytter rekruttering i vivo. Den foreslåtte metoden bruker menneskelige umbilical blodåre endotelceller (HUVEC), som er generert gjennom en veletablert protokoll isolasjon fra menneskelige kontrollkabler. Denne kliniske ressursen har fordelen av å lett tilgjengelig som et biologisk biprodukt, samtidig gir en rimelig avkastning av endotelceller som kan isoleres fra navle venen. Vi brukte også fluorescerende fargestoffer og immunofluorescence for å skille mellom forskjellige cellulære komponenter og AC confocal mikroskopi utvetydig definere monocytt posisjonering (luminal vs. abluminal) over tid. Protokollen presenteres her er utviklet til samtidig måle transmigration nivåer av monocyte subpopulasjoner. Videre bør det bemerkes at denne metodikken kan utvides for å studere andre leukocytter subpopulasjoner og rekrutteringsprosesser ved bruk av forskjellige biomarkers og merking.

Protocol

Menneskelige materialer ble brukt med samtykke av frivillige donorer og i samsvar med den sveitsiske komiteer på klinisk forskning. 1. isolering og frysing av menneskelig Umbilical vene endotelceller (HUVEC) Legge til 5 mL belegg løsning en MT75 kolbe (0,1 mg/mL kollagen G og 0,2% gelatin i fosfat bufret saltvann PBS ved pH 7.4) i 30 min på 37 ° C før du starter HUVEC isolasjon. Rengjør ledningen med PBS, tørk av den med sterilt komprimerer og plassere den i et steri…

Representative Results

Bestemme tilstanden i HUVEC aktivering av TNFα Bio-aktiviteten av inflammatoriske cytokin TNFα kan variere avhengig av batchen og repletion av frysing-tining syklus. Det er viktig å sjekk aktivisering rang av HUVEC med TNFα behandling. Dette kan utføres av flekker parallelt noen prøver av confluent HUVEC for inflammatorisk induksjon av selectins, ICAM-1 og VCAM-115,16…

Discussion

Her rapporterer vi en metode detaljering en studie av hvordan monocytt subpopulasjoner transmigrate gjennom den betente endotelial monolayer. Metoden diskutert brukt AC confocal mikroskopi i stedet for fase kontrast mikroskopi, som også brukes til å studere monocytt rekruttering under flyt^3,11,19. En stor fordel ved å bruke AC confocal mikroskopi tidsinnstilt bildebehandling er muligheten til å entydig forskjellsbehandle tra…

Materials

Tissue Culture Flasks 75 cm2	TPP	90076	Routine culture of isolated HUVEC
µ-Slide VI 0.4	IBIDI	80606
Centrifuge Tubes 15 mL	TPP	191015
Centrifuge Tubes 50 mL	TPP	191050
Collagen G	Biochrom	L 7213	For coating of cell culture flasks
Gelatin	Sigma-Aldrich	1393	For coating of cell culture flasks
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2)	Sigma-Aldrich	D8537
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2)	Sigma-Aldrich	D8662
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich	R8758
3-Way Stopcocks	BIO-RAD	7328103
penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml	AMIMED	4-02F00-H
Collagenase type 1	Worthington	LS004216
Medium 199 1X avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes	GIBCO	22340020
Bovine Albumin Fraction V	ThermoFisher	15260037
Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg	Millipore	02-102
Heparin Sodium	Sigma-Aldrich	H3149RT
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H6909
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A 4544
EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O	APPLICHEM	A2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC	Miltenyi Biotech	130-100-713	AB_2655150
CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE	Miltenyi Biotech	130-110-807	AB_2657280
Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC	Miltenyi Biotech	130-107-016	AB_2653263
BD Accuri C6 Plus	BD Bioscience
µ-Slide I Luer	IBIDI	80176
CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)	ThermoFisher	C2925
Recombinant human TNFα	Peprotech	300-01A
Recombinant human VEGFA	Peprotech	100-20
NE-1000 Programmable Syringe Pump	KF Technology	NE-1000
Ficoll Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02
Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE	Miltenyi Biotech	130-110-519	AB_2655051
Pan Monocyte Isolation Kit, human	Miltenyi Biotech	130-096-537
Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE	Miltenyi Biotech	130-106-762	AB_2655403
LS columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotech	130-090-976
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	ThermoFisher	H1399
Silicone tubing	IBIDI	10841
Elbow Luer Connector	IBIDI	10802
Female Luer Lock Coupler	IBIDI	10823
Luer Lock Connector Female	IBIDI	10825
In-line Luer Injection Port	IBIDI	10820
Ar1 confocal microscope	Nikon
40X objective	Nikon	40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm
ImageJ Software	NIH