Samtidiga studie av rekrytering av monocyt Subpopulations Under flöde In Vitro
Summary
Här presenterar vi ett integrerat protokoll som mäter monocyt subpopulation människohandel under flöde in vitro-användning av specifika yta markörer och confocal fluorescensmikroskopi. Detta protokoll kan användas för att utforska sekventiell rekrytering steg samt för att profilera andra leukocyt subtyper med andra specifika yta markörer.
Abstract
Rekrytering av monocyter från blodet till riktade perifera vävnader är kritisk till den inflammatoriska processen vid vävnadsskada, tumörutveckling och autoimmuna sjukdomar. Detta underlättas genom en process av fånga från fritt flöde på luminala ytan av aktiverade endotelceller, följt av deras vidhäftning och transendothelial migration (själavandring) i den underliggande drabbade vävnaden. Dock är de mekanismer som stöder förmånliga och innehållsberoende rekrytering av monocyt subpopulationer fortfarande inte helt klarlagt. Därför har vi utvecklat en metod som möjliggör rekrytering av olika monocyt subpopulations samtidigt visualiseras och mätt enligt flöde. Denna metod, baserad på time-lapse confocal imaging, möjliggör entydig distinktionen mellan vidhäftande och livslopp monocyter. Här beskriver vi hur denna metod kan användas för att samtidigt studera rekrytering kaskad av proangiogena och icke-angiogena monocyter in vitro. Denna metod kan dessutom utökas för att studera de olika stegen i rekrytering av upp till tre monocyt populationer.
Introduction
Monocyter utgör beståndsdel fagocytos av den medfödda immuniteten som är väsentliga för att bekämpa patogener, städa upp skadade vävnader, angiogenes och patofysiologin för många sjukdomar inklusive cancer1,2,3 . Monocyter är benmärgen-derived celler består av heterogena subpopulations som cirkulerar i blodet men kan rekryteras till platsen för inflammationen i perifer vävnad genom specifika molekylära mekanismer. Rekrytering kaskader av monocyter, när det gäller leukocyter i allmänhet ifrågasätter olika steg inklusive capture, rullande, kryper, gripande, transendothelial migration (själavandring) och migration genom kärlväggen (basalmembranet och väggmålning celler)4. Dessa steg omfattar huvudsakligen inflammation-inducerad molekyler på endotelceller luminala ytan såsom selectins, glykoprotein ligander, chemokiner, intercellulära och Junktional adhesionsmolekyler och deras receptorer på leukocyter såsom selektin ligander och integriner. Människohandel vägar genom antingen endotelceller korsningar (paracellular) eller genom endothelial cellen kroppen (transcellular) kan användas av leukocyter för att korsa den endoteliala barriär5. Samtidigt monocyter har historiskt dokumenterats för att transmigrate genom transcellular rutten, har potentiella skillnader i deras flyttande väg föreslagits som monocyter betraktas inte längre ett homogent cell befolkningen. Det blir nu tydligt att monocyt mångfald kan definieras av varje deras skillnader och likheter, med avseende på deras särskiljande extravasering kaskader3,6. Därför för att otvetydigt diskriminera mellan monocyt subpopulations, är det avgörande att visualisera och fenotyp beteendet hos var och en av dessa olika subpopulations under rekrytering bearbeta.
Monocyter från mänskliga, gris, råtta och mus var uppdelat i fenotypisk subpopulationer med vissa tillskrivs funktioner och specifika flyttande beteenden7,8,9. Till exempel i människor, kan monocyter delas in i tre undergrupper baserat på deras yta uttryck för CD14, en coreceptor för bakteriell lipopolysackarid och CD16, Fc-gamma receptorn III. Mänskliga monocyt subpopulations inkluderar klassisk CD14+CD16–, mellanliggande CD14+CD16+ och icke-klassisk CD14dimCD16+ celler6,9. Den klassiska CD14+CD16– monocyter visade sig vara främst inflammatoriska medan poolen av CD16+ monocyter befanns kollektivt presenterar TIE2 uttryck och proangiogenic funktion10. Konsekvent, endotelceller stimulering med inflammatoriska cytokiner såsom mänskliga tumör nekros faktor (TNF)-α eller interleukin (IL-1) beta (konventionella inflammation) är tillräcklig för att utlösa komplett rekrytering av klassiskt CD14+CD16 – monocyter. Samtidiga handlingar av vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) A och TNFα (angiogena faktorer-driven inflammation) krävs dock att provocera transmigrationen av CD16+ proangiogenic pool av monocyter3. Historiskt, traditionella Transwell systemet under statiska förhållanden, parallellt plattan flöde kammaren och µ-slide flöde kamrarna har använts för att kvantitativt analysera rekrytering av en leukocyt befolkningen på en tid in vitro-11 ,12,13. Medan dessa protokoll har validerats, skulle en mer robust metod som tillät den samtidig analysen av flera monocyt subpopulations anses mer insiktsfulla. Sådana metoder måste redogöra för flera interaktioner och de olika frekvenserna av varje respektive befolkningen och även ge en mekanistisk förståelse av likheter och särdrag för rekrytering kaskader som definierar varje monocyt delmängd.
Här presenterar vi en metod baserad på den time-lapse avbildning av monocyt rekrytering under flöde vilket gör de flyttande kaskader av olika monocyt subpopulations studeras samtidigt med hjälp av konfokalmikroskopi. Den här metoden integrerar vissa kritiska funktioner som efterliknar endotelceller inflammation, liksom hemodynamiken av cirkulerande monocyter i efter kapillär venoler, leukocyt rekrytering invivo huvudsakliga lokalisering. Den föreslagna metoden använder mänskliga navel ven endotelceller (HUVEC), som genereras genom en väletablerad protokoll av isolering från mänskliga navelsträngar. Denna kliniska resurs har fördelen att vara lätt tillgängliga som biologiska biprodukt, samtidigt också ge en rimlig avkastning av endotelceller som kan isoleras från navelsträngen venen. Vi använde också fluorescerande färgämnen och immunofluorescens för att skilja mellan olika cellulära komponenter och konfokalmikroskopi att entydigt definiera monocyt positionering (luminala vs. abluminal) över tid. Det protokoll som presenteras här har utvecklats att samtidigt mäta själavandring nivåerna av monocyt subpopulations. Det bör dessutom noteras att denna metod kan utvidgas för att studera andra leukocyter subpopulationer och rekryteringsprocesser genom användning av olika biomarkörer och märkning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi rapporterar här, en metod som beskriver en studie av hur monocyt subpopulations transmigrate genom den inflammerade endothelial enskiktslager. Den diskuterade metoden används konfokalmikroskopi istället för faskontrast mikroskopi, som också används för att studera monocyt rekrytering under flöde3,11,19. En stor fördel med att använda konfokalmikroskopi för time-lapse imaging är förmågan att entydigt diskriminera…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Paul Bradfield för manuskriptet läsning och återkopplingar. A. S. fick ekonomiskt stöd från Sir Jules Thorn välgörande utomeuropeiska Trust Reg.,
Materials
| Tissue Culture Flasks 75 cm2 | TPP | 90076 | Routine culture of isolated HUVEC |
| µ-Slide VI 0.4 | IBIDI | 80606 | |
| Centrifuge Tubes 15 mL | TPP | 191015 | |
| Centrifuge Tubes 50 mL | TPP | 191050 | |
| Collagen G | Biochrom | L 7213 | For coating of cell culture flasks |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | 1393 | For coating of cell culture flasks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 3-Way Stopcocks | BIO-RAD | 7328103 | |
| penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml | AMIMED | 4-02F00-H | |
| Collagenase type 1 | Worthington | LS004216 | |
| Medium 199 1X avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes | GIBCO | 22340020 | |
| Bovine Albumin Fraction V | ThermoFisher | 15260037 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg | Millipore | 02-102 | |
| Heparin Sodium | Sigma-Aldrich | H3149RT | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H6909 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A 4544 | |
| EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O | APPLICHEM | A2937.0500 | |
| CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC | Miltenyi Biotech | 130-100-713 | AB_2655150 |
| CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-807 | AB_2657280 |
| Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC | Miltenyi Biotech | 130-107-016 | AB_2653263 |
| BD Accuri C6 Plus | BD Bioscience | ||
| µ-Slide I Luer | IBIDI | 80176 | |
| CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | ThermoFisher | C2925 | |
| Recombinant human TNFα | Peprotech | 300-01A | |
| Recombinant human VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
| NE-1000 Programmable Syringe Pump | KF Technology | NE-1000 | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-519 | AB_2655051 |
| Pan Monocyte Isolation Kit, human | Miltenyi Biotech | 130-096-537 | |
| Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE | Miltenyi Biotech | 130-106-762 | AB_2655403 |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | ThermoFisher | H1399 | |
| Silicone tubing | IBIDI | 10841 | |
| Elbow Luer Connector | IBIDI | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | IBIDI | 10823 | |
| Luer Lock Connector Female | IBIDI | 10825 | |
| In-line Luer Injection Port | IBIDI | 10820 | |
| Ar1 confocal microscope | Nikon | ||
| 40X objective | Nikon | 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm | |
| ImageJ Software | NIH |
References
- Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).
- De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).
- Sidibe, A., et al. Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours. Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).
- Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).
- Chamorro, S., et al. In vitro differentiation of porcine blood CD163− and CD163+ monocytes into functional dendritic cells. Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).
- Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood. Blood. 74 (7), (1989).
- Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
- Bradfield, P. F., et al. JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation. Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).
- Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation. Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).
- Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha. Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).
- ibidi GmbH. . Shear Stress and Shear Rates for ibidi µ-Slides – Based on Numerical Calculations. , (2014).
- Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Yang, C. -. R., Hsieh, S. -. L., Ho, F. -. M., Lin, W. -. W. Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression. Journal of Immunology. 174 (3), 1647-1656 (2005).
- Wong, D., Dorovini-Zis, K. Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture. Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).
- Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
- Bradfield, P. F., et al. Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques. PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).
