Summary
Здесь мы представляем протокол для оценки целостности барьер крови яичка путем впрыскивать инулин FITC в яичках. Это эффективно в vivo метод для изучения крови яички барьер целостности, которая может быть скомпрометирована генетических и экологических элементов.
Abstract
Сперматогенез является развитие сперматогонии в зрелых сперматозоидов в семенных канальцев яичек. Этот процесс поддерживается соединения клеток Сертоли на крови яички барьер (BTB), который является плотные ткани барьер в организме млекопитающих и сегрегирует семенных эпителия в двух отсеков, базальный и adluminal. BTB создает уникальный микроокружение для клетки семенозачатка в мейоз I / II и для развития postmeiotic сперматид в сперматозоидов через spermiogenesis. Здесь мы описываем надежный пробирного контролировать целостность BTB мыши яичка в естественных условиях. Нетронутыми BTB блокирует распространение FITC-конъюгированных инулин из базальных апикальной отсек семенных канальцев. Этот метод подходит для изучения генов кандидатов, вирусы или экологических токсикантов, которые могут повлиять на функцию BTB или целостность, с простой процедурой и минимальное требование хирургических навыков, по сравнению с альтернативными методами.
Introduction
У млекопитающих сперматогенез считается весьма структурированный процесс, который охватывает сперматогониальные самообновлению и дифференциация через сперматоцитах в haploid сперматозоидов через митоз, мейоз и spermiogenesis, во время которого драматического биохимические и морфологические изменения происходят. Постепенно развивающиеся клетки семенозачатка перевозятся от основания семенных канальцах сторону просвета. Этот процесс регулируется ячеек контактов между зародышевых клеток и клеток Сертоли1,2. Соседние клетки Сертоли образуют BTB, который расположен рядом с базой семенных канальцах. BTB физически делит эпителия на базальную и adluminal отделения. Во время этапа VIII - IX эпителиальных цикла, сперматоцитах preleptotene/leptotene от базальной отсеков мигрируют по BTB, ввод в adluminal отсеков3. Таким образом функция BTB является предоставить immunoprivileged микроокружение для завершения мейоза и spermiogenesis4,5,6. В отличие от других крови тканевые барьеры (например, blood - brain барьер) которые состоят только из плотных узлов (сомони) BTB формируется четыре различных узлов (сомони, ectoplasmic специализаций, разрыв соединения и среднего на основе накаливания Десмосомы) между Сертоли клетки1,7.
Многие исследования использовали генетически измененных мышей, вирусных инфекций и экологических токсикантов расследовать механизмов BTB целостности7,8,9. BTB срыв индуцирует нарушение сперматогенеза и менструальной или бесплодия. Поскольку формирование БТБ и целостность были подтверждены пострадать от контактов между клеток Сертоли8, была использована модель в пробирке , основанный на первичной культуре изолированных клеток Сертоли BTB исследования. Однако эта модель не может точно имитировать BTB динамика в естественных условиях. Кроме того нет такого совместного культуры зародышевых клеток с клеток Сертоли был создан как способной отражать всех соответствующих структурных и функциональных компонентов BTB10,11.
В общем в естественных условиях BTB целостности анализов обычно основаны на малых молекул, как EZ-Link сульфогруппу-ГСЗ-LC-биотин и конъюгированных FITC инулин (инулин FITC). Как правило распространение биотин или инулина FITC от базальной отсека блокируется BTB структуры. Таким образом мы имеем возможность использовать этот метод для оценки масштабов ущерба BTB, по сравнению с контрольными группами. В то время как BTB может быть скомпрометирована с определенными типами раздражителей, таких как лечение с Кадмий хлористый (2CdCl)12, BTB становится доступной для малых молекул, которые в конечном итоге войти в adluminal отделение как индикаторы.
Начале в vivo BTB целостности assay включает инъекции биотина или инулина FITC в яремной вены, которая включает операции и инвазивных, сложным и трудоемким. Кроме того как репортер веществ диффузной через все тело через кровообращение, местные концентрация биотина или инулина FITC в семенных канальцев ограничен. Кроме того системного воздействия могут вызвать иммунных реакций. Здесь мы представляем простой и эффективный в vivo BTB целостности пробирного включение прямого впрыска небольшой Алиготе инулин FITC в интерстиции яичка. Флуоресцентные метки метода, процесс окрашивания удобно использовать, как вторичные антитела не требуются. Здесь визуализировать процесс Люминесцентную краску, введя яички.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все выполненные эксперименты на животных были утверждены Комитетом медицинского университета Нанкин. Самцов мышей C57BL/6 хранились в контролируемых фотопериода условиях и были поставлены с пищей и водой.
1. Подготовка
-
Микроинъекции капилляров
- Используйте микроинъекции капилляров с наружным диаметром, Внутренний диметр и длина 1,0 мм, 0.8 мм и 10,0 см, соответственно.
- Вытяните стеклянных капилляров с капиллярной съемник (рис. 1A). Проверить и настроить параметры в зависимости от капиллярной съемник машина, которая используется.
- Разорвать наконечники с щипцами для использования для получения капилляров диаметром 50 микрон на кончике.
Примечание: Советы могут быть слишком длинным, чтобы проникать яички. - Точить кончиком в угол 30° с помощью микропипеткой установка (рис. 1 c).
-
Реактивы
- Подготовка 1% Пентобарбитал натрия: растворить Пентобарбитал натрия 100 мг в 10 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS) (шаг 2.3.3).
- Подготовка 10 мг/мл инулин FITC: растворить инулин FITC 1 мг в 100 мкл PBS (шаг 2.1.6).
- Подготовить параформальдегида 4%: растворить параформальдегида (PFA) 4 g в 100 мл PBS (шаг 2.3.3).
- Подготовка 30% сахарозы: растворить сахарозы 3 g в 10 мл PBS (шаг 2.3.4).
- Подготовить 0,1% хлорид кадмия: растворить Кадмий хлористый 10 мг в 10 мл PBS (шаг 2.1.1).
2. методы
-
Анестезия и presurgery подготовка
- Весят 8-недельных самцов мышей C57BL/6 и рассчитать необходимые дозы CdCl2. Относиться к группе мышей (n = 3) с2 CdCl (5 мг/кг веса тела, и.п.) для 3 d до операции. Лечить еще одна группа 8-недельных самцов мышей C57BL/6 (n = 3) с PBS как элемент управления.
- Выполняют операции в асептических условиях с помощью стерильного шприца, иглы, ножницы и пинцет.
- Свеже Подготовьте анестезии рабочие решения. Необходимая доза наркоза-70 мг Пентобарбитал натрия/кг массы тела. В среднем Взрослый C57BL/6 мышь в возрасте 8 недель весит ~ 25 г, что соответствует 175 мкл Пентобарбитал натрия 1% (1,75 мг на мыши).
Примечание: Пентобарбитал натрия растворяют в стерильной фосфат амортизированное saline (PBS). Решение фильтруется по 0,22 мкм фильтр перед их использованием. - Чистота области хирургии с 75% этанола и охватывают область с полотенцем чистой ткани.
- Включите Термостатический подогреватель и отрегулировать температуру до 37 ° C.
- Подготовьте инулин FITC рабочего раствора (10 мг/мл) в день операции.
-
Хирургическая процедура
- Весят 8-недельных самцов мышей C57BL/6 и рассчитать необходимые дозы анестезии.
- Выполните внутрибрюшинного введения Пентобарбитал натрия с использованием 1 мл стерильного шприца. Держите мышь в чистой клетке.
- Соблюдайте глаз рефлекторной реакции и ритм дыхания, мыши, чтобы подтвердить, что она находится под полным наркозом.
Примечание: Обычно 10-15 мин необходимы до тех пор, пока мышь находится глубоко под наркозом, полное отсутствие мыс щепотку ответ и обслуживании медленное, Постоянное дыхание. - Переместить мышь в районе операции и охватывают области его глаз с влажные папиросной бумаги, чтобы избежать сухости во время анестезии (рисунок 2A).
- Побрить его живота волос с бритвы и дезинфицировать области хирургии с 75% этанола.
- Острыми ножницами делают разрез кожи 1 см выше препуция желез подвергать брюшной стенки. Поднимите брюшной стенки с небольшой щипцами и сделать 0,5 см разрез подвергать брюшной полости (рис. 2B).
- Используйте щипцы для поиска жировых отложений вокруг яичка и придатка яичка. Осторожно выдвиньте жировых отложений подвергать прилагаемый яички четко (рис. 2 c и 2D). Как правило работают на одного яичка одновременно.
Примечание: Не прикасайтесь жировых отложений и яичка с руками. - Поместите бумагу (9 см в диаметре) под жировых отложений и яички (рис. 2 c).
- Инулин FITC придать микроинъекции пипетки и подключить его к микроманипулятор блок (рис. 1 d). Аккуратно вставьте дозатор микроинъекции под белочной и загрузить в общей сложности 20 мкл инулин FITC в интерстиции яичка (Рисунок 2E и 2F).
Примечание: Тщательно отпустите пипетки микроинъекции во избежание его перемещения. - Мониторинг движения инулин FITC в яичка (рис. 2 g).
- Немедленно вернуть яичка в брюшной полости после завершения инъекций.
- Повторите процедуру на контралатеральной яички. Этот яички вводят 20 мкл PBS как элемент управления.
- Закройте кожи с шовного и переместить мышь на площадку тепла Термостатический подогреватель (рис. 1B). Администрирование в дозе 1 мг обезболивающее (бупренорфин) на 1 кг массы тела через подкожные инъекции.
-
Уборки семенников и замороженной секции подготовки
- 40 мин после инъекции, усыпить получателя мыши от шейки матки дислокации по уходу за животными и использовать руководящие принципы.
- Используйте пару острых ножниц собирать яички. Поместите яички в 1 мл ледяной PBS для удаления любого заражения крови.
- Исправить яичек в параформальдегида 4% (PFA) при 4 ° C для 12-24 ч. отменить 4% PFA и мыть ткань 3 x 1,5 мл 1% PBS при комнатной температуре.
- Обезвоживает ткани в 30% сахарозы на ночь. Поместить яички в рамках внедрения и покрывают ткани с оптимального раскроя температура смеси (OCT). После октября замораживается, заполните внедрения кадр с октября так, что весь яички могут быть покрыты с Окт.
- Cut-толщиной 5 мкм, замороженных сечений яичек в криостата при-20 ° C и пусть они придерживаться скольжениях микроскопа.
Примечание: Замерзания встроенных ткани в сухой лед может увеличить жесткость для резки.
-
Реквизиции изображения
- Место слайды в коробке увлажненной. Теплый слайды при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Вымойте секции 3 x с трис амортизированное saline (TBS) при комнатной температуре.
- Просушите на 5 мин в темноте. Стереть любые остаточные TBS с бумажной пыли.
- Обложка сечений с 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Перевернутый coverslip место на слайде микроскопа.
- Получение изображений с помощью конфокального микроскопа. В общей сложности 20 X увеличение как правило, достаточно для обнаружения ярких флуоресцентного сигнала.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Экспериментальная установка для выполнения анализа целостности BTB показан на рисунке 1. Тянуть и точить микроинъекции капилляров с капиллярной съемник и микропипеткой оборудованием, соответственно (рис. 1A и 1 C). Термостатический подогреватель и оборудование для микроинъекции проиллюстрированы в Рисунок 1B и 1 D.
Рисунок 2 показывает некоторые из ключевых шагов для инъекций инулин FITC. Используйте ножницы, чтобы сделать небольшой надрез, после того, как мышь подверглась полной анестезии (рисунок 2A и 2B). Яички мыши подвергаются и вводят с Люминесцентную краску с помощью пипетки микроинъекции (рис. 2 c - 2 G).
Рисунок 3 показывает типичный изображения исследование для оценки целостности BTB, на основе анализа в естественных условиях . Мышей в CdCl2-группы лечения вводят с острой дозы CdCl2 (5 мг/кг веса тела, и.п.) на 3 суток. Диффузия инулин FITC от базальной отсека блокируется BTB структуры в контрольной группе, в то время как строительство BTB повреждена и инулина (зеленая Флуоресценция) проходы в апикальной отсек эпителия семенных в CdCl2 -лечение группы. Белая линия сегменты указывают расстояние, пройденное инулин из базальной мембраны (рис. 3A). Степень повреждения BTB определяется расстояние. Для эллиптической люмен радиус составляет в среднем короткий и длинный расстояние от базальной отсек к центру тубуса. Мы используем такой показатель как индекс степень повреждения BTB:
Здесь Dинулин – расстояние, пройденное инулин из базальных отсека и DRadius представляет радиус же семенных канальцах (рис. 3B). Нетронутыми BTB в Rictorfl / + мышей блокирует распространение инулин через барьер вступить в апикальной отделение. В отличие от Rictorcko мышей имеют скомпрометированных BTB, разрешительные инулин диффузии (рис. 3 c).
Рисунок 1: Оборудование для мыши яичка интерстициальных микроинъекции. (A) тянуть стеклянных капилляров с вертикальной капиллярного съемник. ()B) Эта группа показывает Термостатический подогреватель. (C) советы заостряются, используя микропипеткой оборудованием. (D) группа по микроинъекции включает в себя микроинъекции насоса и стерео Микроскоп. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Представитель изображений в vivo яичка интерстициальных микроинъекции разбирательства в мышь. (A) Эта группа показывает удаление брюшной волос от бритвы. (B) Эта группа показывает разрез брюшной стенки 0,5 см подвергать брюшной полости. (C) Вытяните толстый колодки подвергать прилагаемый яички ясно. (D) Эта группа показывает положение яичка и придатка яичка. (E) Эта группа показывает положение микроинъекции пипеткой. (F) Вставка микроинъекции пипетку в интерстиции яички. (G) Эта группа показывает яичка с успешным инъекции в интерстиции семенников. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Исследование для оценки целостности BTB, основанное на в естественных условиях функциональной assay. Взрослых самцов мышей (n = 3 в группе лечения и в контрольной группе) лечение с CdCl2 (5 мг/кг веса тела, и.п.) за 3 дня (лечение группа) или лечить с PBS на 3 дня (контрольная группа). Инулин-FITC (зеленая Флуоресценция) расположен недалеко базе семенных канальцах в контрольной группе, в то время как инулин FITC инициирует проход через BTB в группе CdCl2-лечения. (A) в этой панели, белая линия сегменты указывают расстояние инулин FITC вторгается. Масштаб гистограммы являются 20 мкм. (B) данные из БТБ целостности проб приведены в этой гистограммы, которые показывают расстояние, пройденное инулин (Dинулин) против радиус же трубочку D (радиус). Восьмидесяти трубочки выбираются случайным образом. P < 0,001 (Студенческая t-тест). (C) BTB целостность нарушалась в семенниках мышей RictorСКО . В Rictorcko мыши трубочки инулин проникает глубоко внутри эпителия семенных, достигнув трубочку люмен. Масштаб гистограммы являются 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сперматогенез занимает место в эпителии семенных и является весьма упорядоченный и динамичный процесс, который регулируется зародышевых клеток и соматических клеток (например, клеток Сертоли)13. BTB структуры, которая построена путем клеток Сертоли, делит семенных эпителия на базальную и апикального отсек. Развитие аномалий и haploid клетки семенозачатка происходит в апикальной отсека, который образует иммунологический барьер14.
BTB функция может быть нарушена токсикантов или из-за дефекты генов, участвующих в формировании клеток развязок, ведущих к мужского бесплодия. Чтобы проверить целостность BTB, в vitro была создана система культуры клеток Сертоли, который способен формировать функциональные эпителия, что тесно имитирует BTB в vivo15. Эта система в vitro обеспечивает простую модель для изучения структуры и функции соединения клеток Сертоли. Однако клеток Сертоли изолированы от семенников и культивировали в vitro ограничены в отношении животных возрастом и клеток плотность15,16. Кроме того17мониторинг чистоты клеток Сертоли и присутствие данное, подражая BTB функции должны быть. Еще более важно, BTB структуры и целостности также требуют взаимодействия между зародышевых клеток и клеток Сертоли, как видно из исследований зародышевых клеток специфичные null мутантных мышей с BTB дефекты10,18,19. Таким образом создание совместного культуры зародышевых клеток Сертоли клеток в пробирке , цель изложив все функции решающее значение в vivo BTB остается сложной11,20.
Этот протокол описывает метод оценки BTB добросовестности в vivo путем инъекций инулин FITC, который был модифицирован из процедуры Чэнь и др. 21. Протокол описывает анестезии самцов мышей, воздействия брюшной полости, микроинъекции красителя в интерстиции яички, уборки семенников и резки их на замороженные разделы и приобретение изображений. Для успешного завершения следует отметить несколько шагов. Во-первых важно использовать соответствующие дозы анестезии, потому что сильно глубокий наркоз может привести к смерти. Кроме того длина кончика инъекции капилляров не должно быть слишком длинным; в противном случае пипетки не может проникнуть яички.
Процедуры, представленные здесь могут быть использованы для анализа роли вирусов, ядовитых химических веществ или кандидат белков, участвующих в регуляции BTB. Этот assay чувствительных, надежной и доступной для мониторинга BTB добросовестности в vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана национальной ключ R & D программы Китая (2016YFA0500902), Национальный фонд Китая естественных наук (31471228, 31771653), научный фонд Цзянсу для выдающихся молодых ученых (BK20150047), естественные науки Фонд провинции Цзянсу (BK20140897, 14KJA180005) и инновационной и предпринимательской программы провинции Цзянсу на К.Ж
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary puller | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclone (USA) | SH30258.01 | dilution to 1× in ddH2O |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma (USA) | F6057 | |
| Adhesion microscope slides | CITOGLAS (China) | 80312-3161 | |
| Cadmium chloride | Sigma (USA) | 655198-5G | |
| Confocal microscope | Zeiss (Germany) | LSM700 | |
| Dust-free paper | Kimberly-Clark (USA) | 34120 | |
| Inulin-FITC | Sigma (USA) | F3272 | |
| Microinjection capillaries | Zhengtianyi (China) | BJ-40 | 1.0 mm × 0.8 mm × 100 mm |
| Micropipette beveler | NARISHIGE (JAPAN) | EG-400 | |
| OCT | SAKURA (JAPAN) | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma (USA) | P6148 | |
| Pentobarbital sodium | Merck (Germany) | P11011 | |
| Shaver | Yashen (China) | ||
| Stereo microscope | Nikon (JAPAN) | SMZ1000 | |
| Sucrose | Sangon Biotech (China) | A610498 | |
| Surgical instruments | Stronger (China) | scissors, forceps, needle holder | |
| Syringe | KDL (China) | 20163150518 | 0.45 mm × 0.16 mm RW LB |
| thermostatic heater | KELL (Nanjing, China) | KEL-2010 | |
| 10x TBS, pH 7.6 | |||
| 0.2 M Tris | Sangon Biotech (China) | A600194 | |
| 1.37 M Nacl | Sangon Biotech (China) | A610476 |
References
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).
- Wen, Q., et al. Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons. Tissue Barriers. 4 (4), e1265042 (2016).
- Wang, C. Q., Cheng, C. Y. A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).
- Fijak, M., Meinhardt, A.
- O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue? Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).
- Li, N., Wang, T., Han, D. Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis. Frontiers in Immunology. 3, 152 (2012).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).
- Govero, J., et al. Zika virus infection damages the testes in mice. Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).
- Jenabian, M. A., et al. Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults. AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).
- Holembowski, L., et al. TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis. Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).
- Legendre, A., et al. An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential. Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).
- Setchell, B. P., Waites, G. M. Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat. Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).
- Griswold, M. D. The central role of Sertoli cells in spermatogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).
- Cheng, C. Y., Mruk, D. D. The blood-testis barrier and its implications for male contraception. Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics. Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).
- Orth, J. M. Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study. Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).
- Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis? Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).
- Bai, S., et al. A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis. Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).
- Korhonen, H. M., et al. DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium. Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).
- Loir, M. Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study. Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).
- Chen, H., et al. Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay. Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).
