Planta de crescimento e transformação de Floral-mergulho mediada por Agrobacterium do Extremophyte Schrenkiella parvula
Summary
Transformação mediada por Agrobacterium, usando um método de imersão floral pode ser empregada com sucesso para criar linhas transgênicas estáveis do modelo extremophyte Schrenkiella parvula. Apresentamos um protocolo modificado do que para a Arabidopsis thaliana, considerando o crescimento de diferentes hábitos e características fisiológicas do extremophyte.
Abstract
Schrenkiella parvula é uma extremophyte adaptada a vários estresses abióticos, incluindo várias tensões de toxicidade do íon. Apesar da alta qualidade genômicos recursos disponíveis estudar como as plantas se adaptam ao meio ambiente salienta, seu valor como um modelo de genômica funcional e ferramenta tem sido limitada pela falta de um sistema de transformação praticável. Neste protocolo, relatamos como gerar transgénicos estável S. parvula linhas usando um método de imersão floral mediada por Agrobacterium. Nós modificamos o protocolo de transformação utilizado para a. thaliana para contabilizar características únicas de S. parvula, como um hábito de florescimento indeterminado e um teor de ceras epicuticulares alta nas folhas. Brevemente, S. parvula sementes foram estratificadas em 4 ° C por cinco dias antes do plantio. As plantas foram cultivadas em um fotoperíodo de uma luz de 14 h e 10 h escuro e uma 130 µmol m-2s-1 intensidade luminosa, a 22 ° C a 24 ° C. Oito a nove semanas plantas com várias inflorescências foram selecionados para a transformação. Estas inflorescências foram mergulhadas em uma solução de infiltração de Agrobacterium tumefaciens GV3101 carregando o plasmídeo pMP90RK . Foram realizadas duas rodadas de flor mergulhando com um intervalo de três a quatro semanas para aumentar a eficiência de transformação. As sementes de T1 foram coletadas e secas por quatro semanas em um recipiente com dessecantes antes de germinação a tela para o candidato transformado linhas. Resistência à BASTA foi usada para plantas T1 de tela. Atingimos a solução BASTA três vezes com um intervalo de três dias, começando com duas semanas de plantas para reduzir falsos positivos. Um teste de gota BASTA foi realizado em sobreviver plantas individuais para identificar o verdadeiro transformants positivo. A eficiência de transformação foi 0.033%, rendendo 3 – 4 plantas transgénicas por 10.000 sementes de T1 propagadas.
Introduction
Neste protocolo, descrevemos o crescimento e a criação de linhas transgênicas estáveis para o modelo extremophyte Schrenkiella parvula. A disponibilidade de um sistema eficiente de transformação é uma marca registrada de qualquer modelo genético versátil. Plantas que prosperam em ambientes extremos, referido como extremophytes, fornecem um recurso crítico para compreender as adaptações de plantas a estresses ambientais. Schrenkiella parvula (anteriormente Thellungiella parvula e Eutrema parvulum) é um tal modelo de extremophyte, com a expansão de recursos genômicos1,2,3,4,5. No entanto, os protocolos de transformação não ainda foram relatados para S. parvula em estudos publicados.
O genoma de S. parvula é o primeiro genoma de extremophyte publicado em Brassicaceae (repolho mostarda família) e mostra uma extensa synteny geral do genoma com o modelo de não-extremophyte, Arabidopsis thaliana1. Assim, estudos comparativos entre a. thaliana e S. parvula poderiam se beneficiar da riqueza dos estudos genéticos realizado na a. thaliana tornar informativos hipóteses sobre como o genoma de s. parvula evoluiu e regulamentada forma diferente para lidar com extrema ambiental salienta5,6,7. S. parvula é uma das espécies mais tolerante a sal (baseadas no solo NaCl LD50) entre parentes silvestres conhecidos da . thaliana8. Além da tolerância de NaCl, S. parvula sobrevive e completa seu ciclo de vida na presença de vários íons de sal em altas concentrações tóxicas para a maioria das plantas7. Em resposta às estresses abióticos prevalentes em seu habitat natural, evoluiu várias características, entre os quais vários têm sido estudados com a bioquímica ou fisiológica nível 8,9,10, 11.
Desde 2010, foram mais de 400 publicações peer-reveiwed que usou S. parvula como espécie-alvo ou usado em uma comparação com outras genomas de planta. No entanto, um gargalo claro poderia ser identificado com um olhar mais atento de que tipo de estudos têm sido realizados. A maioria destes relatórios discutir o potencial de uso dos S. parvula em estudos futuros, ou usá-lo em Genômica comparativa ou estudos filogenéticas. Devido à falta de um protocolo de transformação de prova de conceito estabelecido para S. parvula, ela não tem sido usada em estudos de genômicos funcionais, apesar de ter um dos genomas de planta mais alta qualidade disponíveis até à data (> 5 Mb contig N50) montado e anotados em pseudomolecules cromossomo-nível1.
O método de transformação mediada por Agrobacterium de floral-mergulho tornou-se o método mais amplamente utilizado para criar linhas de trasngenic na . thaliana, e o desenvolvimento de um sistema reprodutível da transformação foi um fator crítico de seu sucesso como um modelo genético12,13. No entanto, nem todas as espécies de Brassicaceae foram mostradas para ser com êxito transformada usando o método de imersão floral desenvolvido pela . thaliana. Especialmente, as espécies de Brassicaceae Lineage II que incluem S. parvula tem sido recalcitrantes a transformação com base floral-mergulho métodos14,15.
O hábito de crescimento indeterminado floração de S. parvula, combinada com sua morfologia de folhas estreitas tornou desafiador para adotar o método de transformação de floral-mergulho padrão mediada por Agrobacterium. Neste estudo, nós relatamos o protocolo modificado que desenvolvemos para transformação reprodutível de S. parvula.
Protocol
Representative Results
Discussion
O estado fisiológico da planta influencia significativamente a eficiência de transformação25. O uso de plantas saudáveis e vigorosas para transformação é um requisito-chave para a transformação bem sucedida em S. parvula. Água ou plantas estressadas luz terá menos flores em comparação com as ideal de transformação (Figura 1, painel central) de plantas saudáveis. S. parvula pode crescer em uma intensidade de luz menos de 130 µmol m<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por um prêmio da National Science Foundation 1616827 MCB.
Materials
| Agar | VWR International, Radnor, PA | 90000-762 | Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics |
| B5 vitamins | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1019 | Gamborg’s Vitamin Solution |
| Desiccant | W A Hammond Drierite, Xenia, OH | 22005 | Indicating DRIERITE 6 mesh |
| Destination vector for plant transformation | TAIR | Vector:6531113857 | pKGWFS7 |
| Electroporation cuvette | USA Scientific | 9104-5050 | Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap |
| Electroporator | BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA | 1652100 | MicroPulser Electroporator |
| Fertilizer beads | Osmocote Garden, Marysville, OH | N/A | Osmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable |
| Gel extraction kit | iNtRON Biotechnology, Boston, MA | 17289 | MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1914-5G | Gentamicin sulfate |
| Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA) | Bayer environmental science, Montvale, NJ | N/A | FINALE herbicide |
| Kanamycin | VWR International, Radnor, PA | 200004-444 | Kanamycin monosulfate |
| MES | Bioworld, Dublin, OH | 41320024-2 | MES, Free Acid |
| MS salt | MP Biomedicals, Santa Anna, CA | 092621822 | Hoagland's modified basal salt mixture |
| N6-benzylaminopurine (BA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B3274 | 6-Benzylaminopurine solution |
| NaCl | Sigma-Alrich | S7653 | Sodium chloride |
| Non-ionic detergent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 9005-64-5 | TWEEN 20 |
| Plasmid isolation kit | Zymo Research, Irvine, CA | D4036 | Zyppy Plasmid Kits |
| Recombinase enzyme mix kit | Life Technology | 11791-020 | Gateway LR Clonase II Enzyme mix |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | R3501-1G | Rifampicin, powder, >= 97% (HPLC) |
| Shaking incubator | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA | SHKE4450 | MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers |
| Soil mix | Sun Gro | SUN239223328CFLP | Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix |
| Spectinomycin | VWR International, Radnor, PA | IC15206705 | |
| Sterile 50ml conical tubes | USA Scientific, Ocala, FL | 1500-1811 | 50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile |
| Sucrose | VWR International, Radnor, PA | 57-50-1 | Sucrose, ACS |
| Surfactant solution | Lehle seeds, Round Rock, TX | VIS-02 | Silwet L-77 |
| Topoisomerase-based cloning kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | K240020 | pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Tryptone | VWR International, Radnor, PA | 90000-282 | BD Bacto Tryptone, BD Biosciences |
| Yeast Extract | VWR International, Radnor, PA | 90000-722 | BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences |
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