Vekst og Agrobacterium-mediert Floral-dip transformasjonen av Extremophyte Schrenkiella parvula
Summary
Agrobacterium-mediert transformasjon bruke en floral-dip kan brukes å opprette stabil transgene linjer av extremophyte modellen Schrenkiella parvula. Vi presenterer en protokoll endret fra det for Arabidopsis thaliana, vurderer ulike vekst vaner og fysiologiske kjennetegner extremophyte.
Abstract
Schrenkiella parvula er en extremophyte tilpasset ulike abiotiske påkjenninger, inkludert flere ion toksisitet påkjenninger. Til tross for høy kvalitet genomisk ressurser tilgjengelig til å studere hvordan planter tilpasse seg miljøet understreker verdien som funksjonell genomforskning modell og verktøyet har vært begrenset av mangel på en mulig transformasjon system. I denne protokollen, rapporterer vi hvordan å generere stabil transgene S. parvula linjer med en Agrobacterium-mediert blomster-dip-metode. Vi endret transformasjon protokollen som brukes til A. thaliana konto for unike trekk av S. parvula, for eksempel en ubestemmelig blomstrende vane og en høy epicuticular voksen innhold på bladene. Kort, S. parvula frø var lagdelt på 4 ° C i fem dager før planting. Planter ble dyrket på en fotoperiode av et 14 h lys og 10t mørke og 130 µmol m-2s-1 lav intensitet, på 22 ° C til 24 ° C. Åtte til ni uke-gamle planter med flere inflorescences ble valgt for transformasjon. Disse inflorescences var dyppet i en infiltrasjon av Agrobacterium tumefaciens GV3101 bærer pMP90RK plasmider. Vi utført to rundene blomst dipping med et intervall på tre til fire uker å effektivisere transformasjon. T1 frø var samlet og tørket i fire uker i en container med desiccants før spiring skjermen kandidat forvandlet linjer. Motstand mot BASTA ble brukt til skjerm T1 planter. Vi sprayet BASTA løsningen tre ganger med et intervall på tre dager starter på to uke gamle planter å redusere falske positiver. En BASTA drop test ble utført på overlevende personlige planter for å identifisere ekte positiv transformants. Transformasjon effektiviteten var 0.033%, gir 3-4 transgene planter per 10 000 T1 frø overført.
Introduction
I denne protokollen beskriver vi vekst og etablering av stabil transgene linjer for extremophyte modell Schrenkiella parvula. Tilgjengeligheten av en effektiv transformasjon system er et kjennetegn på en allsidig genetisk modell. Plantene som trives i ekstreme miljøer, referert til som extremophytes, gir en kritisk ressurs for å forstå anlegget tilpasninger mot miljømessige belastninger. Schrenkiella parvula (tidligere Thellungiella parvula og Eutrema parvulum) er en slik extremophyte modell, med å utvide genomisk ressurser,1,,2,,3,,4,,5. Men har transformasjon protokoller ikke ennå blitt rapportert for S. parvula i publiserte studier.
Genomet av S. parvula er første publiserte extremophyte genomet i Korsblomstfamilien (sennep-kål familien) og viser en omfattende totale genom synteny med ikke-extremophyte modell, Arabidopsis thaliana1. Dermed komparative studier mellom A. thaliana og S. parvula kan ha nytte av vell av genetiske studier utført på A. thaliana å gjøre informativ hypoteser om hvordan S. parvula genomet har utviklet seg og regulert annerledes for å tåle understreker ekstreme miljø5,6,7. S. parvula er en av de mest salt-tolerant artene (basert på jord NaCl LD50) blant kjente ville slektninger av A. thaliana8. NaCl toleranse, S. parvula overlever og livssyklusen i nærvær av flere salt ioner ved høye konsentrasjoner giftig for de fleste planter7er fullført. Svar på abiotiske stress utbredt i sitt naturlige habitat, den har utviklet seg ulike egenskaper, hvorav flere har blitt studert på biokjemiske eller fysiologiske nivå 8,9,10, 11.
Siden 2010, har det vært over 400 peer-reveiwed publikasjoner som brukes S. parvula som mål art eller brukt i en sammenligning med andre plante genomer. Men kan en tydelig flaskehals identifiseres med en nærmere titt på hva slags studier har vært gjennomført. Fleste av disse rapportene diskutere benytte S. parvula i fremtidige studier eller bruke den i sammenlignende genomisk eller phylogenomic studier. På grunn av mangel på en proof-of-concept transformasjon protokoll etablert for S. parvula, den ikke er brukt i funksjonelle genomisk studier, til tross for at en av høyeste kvalitet anlegget genomer tilgjengelig ennå (> 5 Mb contig N50) samlet og kommentert i kromosom nivå pseudomolecules1.
Metoden Agrobacterium-mediert blomster-dip transformasjon har blitt den mest brukte metoden til å opprette trasngenic i A. thalianaog utvikling av en reproduserbar system transformasjon var en kritisk faktor i suksessen som en genetisk modell12,13. Ikke alle Korsblomstfamilien arter har imidlertid vist forvandles lykkes med metoden blomster-dip utviklet for A. thaliana. Spesielt, har Brassicaceae Lineage II arter som inkluderer S. parvula vært gjenstridige til blomster-dip basert transformasjon metoder14,15.
Ubestemte blomstrende vekst vane S. parvula, kombinert med sine smale blad morfologi har gjort det utfordrende å vedta den standard Agrobacterium-mediert blomster-dip transformasjon metoden. I denne studien rapporterer vi endret protokollen har vi utviklet for reproduserbar transformasjon av S. parvula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fysiologisk tilstand av anlegget betydelig påvirker effektiviteten av transformasjon25. Bruk av sunn og livskraftig planter for transformasjon er viktig for vellykket transformasjon i S. parvula. Vann eller lette stresset planter vil ha færre blomster sammenlignet med de friske plantene ideelt for transformasjon (figur 1, midtre panel). S. parvula kan vokse i lav intensitet mindre enn 130 µmol m-2 s-1, men de pleier å være …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av en National Science Foundation award kalt MCB 1616827.
Materials
| Agar | VWR International, Radnor, PA | 90000-762 | Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics |
| B5 vitamins | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1019 | Gamborg’s Vitamin Solution |
| Desiccant | W A Hammond Drierite, Xenia, OH | 22005 | Indicating DRIERITE 6 mesh |
| Destination vector for plant transformation | TAIR | Vector:6531113857 | pKGWFS7 |
| Electroporation cuvette | USA Scientific | 9104-5050 | Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap |
| Electroporator | BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA | 1652100 | MicroPulser Electroporator |
| Fertilizer beads | Osmocote Garden, Marysville, OH | N/A | Osmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable |
| Gel extraction kit | iNtRON Biotechnology, Boston, MA | 17289 | MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1914-5G | Gentamicin sulfate |
| Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA) | Bayer environmental science, Montvale, NJ | N/A | FINALE herbicide |
| Kanamycin | VWR International, Radnor, PA | 200004-444 | Kanamycin monosulfate |
| MES | Bioworld, Dublin, OH | 41320024-2 | MES, Free Acid |
| MS salt | MP Biomedicals, Santa Anna, CA | 092621822 | Hoagland's modified basal salt mixture |
| N6-benzylaminopurine (BA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B3274 | 6-Benzylaminopurine solution |
| NaCl | Sigma-Alrich | S7653 | Sodium chloride |
| Non-ionic detergent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 9005-64-5 | TWEEN 20 |
| Plasmid isolation kit | Zymo Research, Irvine, CA | D4036 | Zyppy Plasmid Kits |
| Recombinase enzyme mix kit | Life Technology | 11791-020 | Gateway LR Clonase II Enzyme mix |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | R3501-1G | Rifampicin, powder, >= 97% (HPLC) |
| Shaking incubator | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA | SHKE4450 | MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers |
| Soil mix | Sun Gro | SUN239223328CFLP | Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix |
| Spectinomycin | VWR International, Radnor, PA | IC15206705 | |
| Sterile 50ml conical tubes | USA Scientific, Ocala, FL | 1500-1811 | 50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile |
| Sucrose | VWR International, Radnor, PA | 57-50-1 | Sucrose, ACS |
| Surfactant solution | Lehle seeds, Round Rock, TX | VIS-02 | Silwet L-77 |
| Topoisomerase-based cloning kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | K240020 | pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Tryptone | VWR International, Radnor, PA | 90000-282 | BD Bacto Tryptone, BD Biosciences |
| Yeast Extract | VWR International, Radnor, PA | 90000-722 | BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences |
References
- Dassanayake, M., et al. The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula. Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).
- Oh, D. -. H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. Life at the extreme: lessons from the genome. Genome Biology. 13 (3), 241 (2012).
- Whited, J. The Next Top Models. Cell. 163 (1), 18-20 (2015).
- Dassanayake, M., Yun, D. O. D., Bressan, R. A., Cheeseman, J. M., Bohnert, J. H. The scope of things to come: New paradigms in biotechnology. Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century. , 19-34 (2009).
- Dittami, S. M., Tonon, T. Genomes of extremophile crucifers: New platforms for comparative genomics and beyond. Genome Biology. 13 (8), 166 (2012).
- Amtmann, A. Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants. Molecular Plant. 2 (1), 3-12 (2009).
- Oh, D. -. H., Hong, H., Lee, S. Y., Yun, D. -. J., Bohnert, H. J., Dassanayake, M. Genome structures and transcriptomes signify niche adaptation for the multiple-ion-tolerant extremophyte Schrenkiella parvula. Plant Physiology. 164 (4), 2123-2138 (2014).
- Orsini, F., et al. A comparative study of salt tolerance parameters in 11 wild relatives of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 61 (13), 3787-3798 (2010).
- Uzilday, B., Ozgur, R., Sekmen, A. H., Yildiztugay, E., Turkan, I. Changes in the alternative electron sinks and antioxidant defence in chloroplasts of the extreme halophyte Eutrema parvulum (Thellungiella parvula) under salinity. Annals of Botany. 115 (3), 449-463 (2015).
- Teusink, R. S., Rahman, M., Bressan, R. A., Jenks, M. A. Cuticular waxes on Arabidopsis thaliana close relatives Thellungiella halophila and Thellungiella parvula. International Journal of Plant Sciences. 163 (2), 309-315 (2002).
- Jarvis, D. E., Ryu, C. H., Beilstein, M. A., Schumaker, K. S. Distinct roles for SOS1 in the convergent evolution of salt tolerance in Eutrema salsugineum and Schrenkiella parvula. Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 2094-2107 (2014).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
- Bai, J., Wu, F., Mao, Y., He, Y. In planta transformation of Brassica rapa and B. napus via vernalization-infiltration methods. Protocol Exchange. 10, 1028 (2013).
- Sparrow, P. A. C., Goldsack, C. M. P., Østergaard, L. Transformation technology in the Brassicaceae. Genetics and Genomics of the Brassicaceae. , 505-525 (2011).
- Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. California Agricultural Experiment Station Circular. 347 (347), 1-32 (1950).
- Saiki, R., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
- Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, cost-free method of purification of dna fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Bertani, G. Studies on Lysogenesis I. The mode of phage liberation by lysogenic Eschericia coli. Journal of Bacteriolgy. 62 (3), 293-300 (1951).
- Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. Specialized vectors for gene tagging and expression studies. Plant Molecular Biology Manual. , 53-74 (1994).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of Agrobacterium using electroporation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (30), (2006).
- Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research. 8 (19), 4321-4326 (1980).
- Inan, G. Salt cress. a halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles. Plant Physiol. 135 (3), 1718-1737 (2004).
- Ghedira, R., De Buck, S., Nolf, J., Depicker, A. The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (7), 823-832 (2013).
- Shaohong, F. U., Xianya, W. E. I., Yingze, N. I. U., Shixing, G. U. O. Transformation of Brassica napus with the method of floral-dip. Biotechnology: Genomics and Its Applications. , 45-49 (2005).
- Li, J., Tan, X., Zhu, F., Guo, J. A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets. International Journal of Biology. 2 (1), 127 (2010).
- Li, H. Q., Xu, J., Chen, L., Li, M. R. Establishment of an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation of Thellungiella halophila. Plant Cell Reports. 26 (10), 1785-1789 (2007).
- Wu, G., Rossidivito, G., Hu, T., Berlyand, Y., Poethig, R. S. Traffic lines: New tools for genetic analysis in Arabidopsis thaliana. 유전학. 200 (1), 35-45 (2015).
