Här presenterar vi ett protokoll för visualisering, detektering, analys och spårning av endogent mRNA-handel i levande Drosophila melanogaster ägg kammare med hjälp av molekylära beacons, spinning Disc konfokalmikroskopi, och öppen källkod analys Programvara.
Fluorescence-baserade avbildningstekniker, i kombination med utvecklingen i ljusmikroskopi, har revolutionerat hur cell biologer genomföra levande cell avbildning studier. Metoder för att upptäcka rnas har expanderat kraftigt sedan nyskapande studier länkade platsspecifika mRNA lokalisering till gen uttrycks reglering. Dynamiska mRNA-processer kan nu visualiseras via metoder som detekterar mRNAs, tillsammans med mikroskopiuppställningar som är tillräckligt snabba för att fånga det dynamiska utbudet av molekylära beteenden. Molekylär Beacon Technology är en hybridisering-baserad metod som kan direkt detektering av endogena utskrifter i levande celler. Molekylära fyrar är hårnål-formad, internt släckt, single-nucleotide diskriminerande nukleinsyra sonder, som fluorescerar endast vid hybridisering till en unik målsekvens. I kombination med avancerad fluorescens-mikroskopi och högupplöst avbildning gör de det möjligt för en att utföra rumslig och tidsmässig spårning av mRNAs-intracellulär rörelse. Även om denna teknik är den enda metod som kan upptäcka endogena utskrifter, har cell biologer ännu inte helt anammat denna teknik på grund av svårigheter att utforma sådana sonder för levande cell avbildning. En ny programvara applikation, Pinmol, möjliggör förbättrad och snabb design av sonder bäst lämpade för att effektivt hybridisera till mRNA mål regioner inom en levande cell. Dessutom, högupplöst, realtid bild förvärv och nuvarande, öppen källkod bildanalysprogram vara möjliggör en raffinerad dataproduktion, vilket leder till en finare utvärdering av komplexiteten bakom de dynamiska processer som ingår i mRNA livscykel.
Här presenterar vi ett omfattande protokoll för att designa och leverera molekylära beacons till Drosophila melanogaster Egg Chambers. Direkt och mycket specifik detektion och visualisering av endogena maternell mRNAs utförs via spinning Disc konfokalmikroskopi. Imaging data bearbetas och analyseras med hjälp av objektdetektering och spårning i isiga programvara för att få information om den dynamiska rörelsen hos mRNAs, som transporteras och lokaliseras till specialiserade regioner inom äggocyten.
Cellbiologi studier som visualiserar dynamiska händelser med rumslig och tidsmässig upplösning har möjliggjorts genom utveckling av fluorescensbaserade tekniker för levande cell avbildning. För närvarande, in vivo mRNA visualisering uppnås via teknik som är baserade på RNA aptamer-proteininteraktioner, RNA aptamer-inducerad fluorescens av organiska färgämnen och nukleinsyra sond glödgning1,2, 3. de erbjuder alla hög specificitet, känslighet och signal-till-bakgrund förhållande. Men RNA aptamer-centrerad metoder kräver omfattande genetisk manipulation, där en transgenens är konstruerad för att uttrycka ett RNA med konstgjorda strukturella motiv som krävs för protein eller organiska färgämnes bindning. Till exempel kräver MS2/MCP-systemet ett co-Expression av en transgenens som uttrycker en RNA-konstruktion som innehåller flera tandem upprepningar av bindningssekvens för bakteriofagen MS2 Coat protein (MCP), och en annan transgenens som kodar för ett fluorescerande protein smält till MCP4,5. Tillsatsen av sådana sekundära strukturella motiv till RNA, tillsammans med en skrymmande Fluorescent märkta protein, har väckt farhågor om att infödda RNA processer kan påverkas6. En teknik som tar itu med denna oro och erbjuder ytterligare unika fördelar är den nukleinsyra-baserade metoden, molekylära beacons (MBs). MBS möjliggör multiplex detektion av endogena mRNA, diskriminering av enstaka nukleotid variationer, och snabb kinetik av hybridisering med mål mrná7,8. MBs är oligonukleotid sonder som stannar kvar i en släckt hårnål gånger innan de genomgår en fluorogena konformationsförändring när de hybridisera sina mål (figur 1c)9. Flera grupper har haft framgång med att använda MBS för att detektera både icke-kodning av rnas (micrornas och lncrnas)10,11,12,13, RNA retrovirus14 och Dynamic DNA-protein interaktioner15. De har framgångsrikt använts för avbildning i olika organismer och vävnader, såsom zebrafiskar embryon16, nervceller13, tumör vävnad17, differentiera kardiomyocyter18, och salmonella 19.
Här beskriver vi utformningen, leveransen och detekterings metoden för endogena mRNAs i Living D. melanogaster ägg kammare tillsammans med en mikroskopi set-up som är tillräckligt snabb för att fånga det dynamiska utbudet av aktiva molekylära transporter. D. melanogaster Egg Chamber har fungerat som ett idealiskt flercelliga modellsystem för ett brett spektrum av utvecklingsstudier, från tidig köns cells stamcells Division och moderns genuttryck till generering av segmentell Body plan20, 21. Egg Chambers är lätt isolerade, stora och genomskinliga, och kan motstå timmar av ex vivo analys, vilket gör dem mycket mottagliga för Imaging experiment. Mycket arbete har fokuserat på asymmetrisk lokalisering av maternella utskrifter till diskreta subcellulära regioner innan de aktivt översätts. I synnerhet måste Oskar mRNA lokalisering och dess efterföljande översättning vid äggcell-stolpen ske på ett tätt reglerat sätt för att undvika en dödlig bicaudal embryonal fenotyp22. Oskar mRNA transkriberas i de 15 köns cells cellerna, kallas sjuksköterska celler, och aktivt transporteras genom cytoplasmiska broar, kallas ring kanaler, in i äggcell, den köns cells cellen som blir det mogna ägget och slutligen befruktas (figur 1a ). Den avsevärda mängd information som redan finns tillgänglig om den dynamiska rekryteringen och utbytet av protein faktorer till och från Oskar mRNP, tillsammans med dess långväga intracellulära resor, gör Oskar till föredragen kandidat för att studera de många processerna i mRNA livscykel. MBs har varit avgörande för att avslöja detaljer om processen för mRNA lokalisering och dechiffrera regleringen och funktionen av protein faktorer som styr mRNA transport under Drosophila oogenesis. I synnerhet genom att mikroinjicera MBS i sjuksköterska celler och utföra levande cell Imaging experiment, spårning av endogena mrnas är möjligt8,23.
Den färdplan som presenteras här erbjuder stegen i en komplett process, från att utföra en levande cell Imaging experiment med MBs, förvärva Imaging data, att utföra dataanalys för att spåra endogena mRNA i sin inhemska cellulära miljö. Stegen kan modifieras och optimeras ytterligare för att tillgodose behoven hos forskare som arbetar med andra vävnader/celltyper inom sin egen laboratoriemiljö.
Live visualisering av endogena mRNA handel i Drosophila Egg Chambers förlitar sig på användning av specifika, effektiva, och Nuclease-resistenta MBS, som nu kan enkelt utformas med pinmol programvara. MBs är specifika sonder som utformats för att upptäcka unika sekvenser inom en Target mRNA (helst regioner som är fria från sekundär struktur), vilket gör möjligt mycket löst detektering av en avskrift. Den enda begränsningen vid antagande av denna teknik/protokoll för andra vävnader/celltyp…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Salvatore A.E. Marras (Public Health Research Institute Center, Rutgers University) för syntes, märkning och rening av molekylära beacons, och Daniel St Johnston (The Gurdon Institute, University of Cambridge) för Oskar-MS2/ MCP-GFP transgena flug bestånd. Detta arbete stöddes av en National Science Foundation CAREER Award 1149738 och en professionell personal kongress-CUNY Award till DPB.
Spectrofluorometer | Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon | n/a | Photon counting spectrofluorometer |
Quartz cuvette | Fireflysci (former Precision Cells Inc.) | 701MFL | |
Dumont #5 tweezer | World Precision Instruments | 501985 | Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers |
Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
Cover slip No.1 22 x 40mm | VWR | 48393-048 | |
Dissecting microscope | Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. | n/a | |
CO2 fruit fly anesthesia pad | Genesee Scienific | 59-114 | |
Tris-HCL pH7.5 | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
Spinning disc confocal microscope | Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. | n/a | |
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera | Hamamatsu | n/a | |
PatchMan NP 2 Micromanipulator | Eppendorf Inc. | 920000037 | |
FemtoJet Microinjector | Eppendorf Inc. | 920010504 | |
Injection needle: Femtotips II | Eppendorf Inc. | 930000043 | |
Loading tip: 20ul Microloader | Eppendorf Inc. | 930001007 | |
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm | VWR | 48393-026; 48393-172 | |
Dry yeast | Any grocery store | n/a | |
Computer, > 20 GB RAM | Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing |