JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Visualisera och spåra endogena mRNAs i levande Drosophila melanogaster ägg kammare

Published: June 04, 2019
doi:
10.3791/58545
, , ,
1Biological Sciences Department Hunter College,City University of New York, 2Program in Molecular, Cellular, and Developmental Biology,Graduate Center, City University of New York

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för visualisering, detektering, analys och spårning av endogent mRNA-handel i levande Drosophila melanogaster ägg kammare med hjälp av molekylära beacons, spinning Disc konfokalmikroskopi, och öppen källkod analys Programvara.

Abstract

Fluorescence-baserade avbildningstekniker, i kombination med utvecklingen i ljusmikroskopi, har revolutionerat hur cell biologer genomföra levande cell avbildning studier. Metoder för att upptäcka rnas har expanderat kraftigt sedan nyskapande studier länkade platsspecifika mRNA lokalisering till gen uttrycks reglering. Dynamiska mRNA-processer kan nu visualiseras via metoder som detekterar mRNAs, tillsammans med mikroskopiuppställningar som är tillräckligt snabba för att fånga det dynamiska utbudet av molekylära beteenden. Molekylär Beacon Technology är en hybridisering-baserad metod som kan direkt detektering av endogena utskrifter i levande celler. Molekylära fyrar är hårnål-formad, internt släckt, single-nucleotide diskriminerande nukleinsyra sonder, som fluorescerar endast vid hybridisering till en unik målsekvens. I kombination med avancerad fluorescens-mikroskopi och högupplöst avbildning gör de det möjligt för en att utföra rumslig och tidsmässig spårning av mRNAs-intracellulär rörelse. Även om denna teknik är den enda metod som kan upptäcka endogena utskrifter, har cell biologer ännu inte helt anammat denna teknik på grund av svårigheter att utforma sådana sonder för levande cell avbildning. En ny programvara applikation, Pinmol, möjliggör förbättrad och snabb design av sonder bäst lämpade för att effektivt hybridisera till mRNA mål regioner inom en levande cell. Dessutom, högupplöst, realtid bild förvärv och nuvarande, öppen källkod bildanalysprogram vara möjliggör en raffinerad dataproduktion, vilket leder till en finare utvärdering av komplexiteten bakom de dynamiska processer som ingår i mRNA livscykel.

Här presenterar vi ett omfattande protokoll för att designa och leverera molekylära beacons till Drosophila melanogaster Egg Chambers. Direkt och mycket specifik detektion och visualisering av endogena maternell mRNAs utförs via spinning Disc konfokalmikroskopi. Imaging data bearbetas och analyseras med hjälp av objektdetektering och spårning i isiga programvara för att få information om den dynamiska rörelsen hos mRNAs, som transporteras och lokaliseras till specialiserade regioner inom äggocyten.

Introduction

Cellbiologi studier som visualiserar dynamiska händelser med rumslig och tidsmässig upplösning har möjliggjorts genom utveckling av fluorescensbaserade tekniker för levande cell avbildning. För närvarande, in vivo mRNA visualisering uppnås via teknik som är baserade på RNA aptamer-proteininteraktioner, RNA aptamer-inducerad fluorescens av organiska färgämnen och nukleinsyra sond glödgning1,2, 3. de erbjuder alla hög specificitet, känslighet och signal-till-bakgrund förhållande. Men RNA aptamer-centrerad metoder kräver omfattande genetisk manipulation, där en transgenens är konstruerad för att uttrycka ett RNA med konstgjorda strukturella motiv som krävs för protein eller organiska färgämnes bindning. Till exempel kräver MS2/MCP-systemet ett co-Expression av en transgenens som uttrycker en RNA-konstruktion som innehåller flera tandem upprepningar av bindningssekvens för bakteriofagen MS2 Coat protein (MCP), och en annan transgenens som kodar för ett fluorescerande protein smält till MCP4,5. Tillsatsen av sådana sekundära strukturella motiv till RNA, tillsammans med en skrymmande Fluorescent märkta protein, har väckt farhågor om att infödda RNA processer kan påverkas6. En teknik som tar itu med denna oro och erbjuder ytterligare unika fördelar är den nukleinsyra-baserade metoden, molekylära beacons (MBs). MBS möjliggör multiplex detektion av endogena mRNA, diskriminering av enstaka nukleotid variationer, och snabb kinetik av hybridisering med mål mrná7,8. MBs är oligonukleotid sonder som stannar kvar i en släckt hårnål gånger innan de genomgår en fluorogena konformationsförändring när de hybridisera sina mål (figur 1c)9. Flera grupper har haft framgång med att använda MBS för att detektera både icke-kodning av rnas (micrornas och lncrnas)10,11,12,13, RNA retrovirus14 och Dynamic DNA-protein interaktioner15. De har framgångsrikt använts för avbildning i olika organismer och vävnader, såsom zebrafiskar embryon16, nervceller13, tumör vävnad17, differentiera kardiomyocyter18, och salmonella 19.

Här beskriver vi utformningen, leveransen och detekterings metoden för endogena mRNAs i Living D. melanogaster ägg kammare tillsammans med en mikroskopi set-up som är tillräckligt snabb för att fånga det dynamiska utbudet av aktiva molekylära transporter. D. melanogaster Egg Chamber har fungerat som ett idealiskt flercelliga modellsystem för ett brett spektrum av utvecklingsstudier, från tidig köns cells stamcells Division och moderns genuttryck till generering av segmentell Body plan20, 21. Egg Chambers är lätt isolerade, stora och genomskinliga, och kan motstå timmar av ex vivo analys, vilket gör dem mycket mottagliga för Imaging experiment. Mycket arbete har fokuserat på asymmetrisk lokalisering av maternella utskrifter till diskreta subcellulära regioner innan de aktivt översätts. I synnerhet måste Oskar mRNA lokalisering och dess efterföljande översättning vid äggcell-stolpen ske på ett tätt reglerat sätt för att undvika en dödlig bicaudal embryonal fenotyp22. Oskar mRNA transkriberas i de 15 köns cells cellerna, kallas sjuksköterska celler, och aktivt transporteras genom cytoplasmiska broar, kallas ring kanaler, in i äggcell, den köns cells cellen som blir det mogna ägget och slutligen befruktas (figur 1a ). Den avsevärda mängd information som redan finns tillgänglig om den dynamiska rekryteringen och utbytet av protein faktorer till och från Oskar mRNP, tillsammans med dess långväga intracellulära resor, gör Oskar till föredragen kandidat för att studera de många processerna i mRNA livscykel. MBs har varit avgörande för att avslöja detaljer om processen för mRNA lokalisering och dechiffrera regleringen och funktionen av protein faktorer som styr mRNA transport under Drosophila oogenesis. I synnerhet genom att mikroinjicera MBS i sjuksköterska celler och utföra levande cell Imaging experiment, spårning av endogena mrnas är möjligt8,23.

Den färdplan som presenteras här erbjuder stegen i en komplett process, från att utföra en levande cell Imaging experiment med MBs, förvärva Imaging data, att utföra dataanalys för att spåra endogena mRNA i sin inhemska cellulära miljö. Stegen kan modifieras och optimeras ytterligare för att tillgodose behoven hos forskare som arbetar med andra vävnader/celltyper inom sin egen laboratoriemiljö.

Protocol

1. utformning av MBs för levande cell avbildning Vik mål RNA-sekvensen för att förutsäga mRNA Target sekundära struktur med hjälp av “RNA form” från mfold server (http://unafold.RNA.Albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-form). Klistra in/Ladda upp målsekvensen i FASTA-format, Välj 5 eller 10% sub-optimality (strukturer med en fri energi av vikning inom 5 eller 10% av MFE-värdet, respektive), och justera det maximala antalet beräknade vikningar i enlighet därmed (t. ex…

Representative Results

Med Pinmolkan flera MBS utformas för ett mRNA-mål (figur 1b-C). Efter syntes och rening, de valda MBs kännetecknas och jämförs med in vitro-analys. Figur 1: teknik-och vävnads beskrivning för levande cell avbildning av endogena mRNAs. Aavbildning av e…

Discussion

Live visualisering av endogena mRNA handel i Drosophila Egg Chambers förlitar sig på användning av specifika, effektiva, och Nuclease-resistenta MBS, som nu kan enkelt utformas med pinmol programvara. MBs är specifika sonder som utformats för att upptäcka unika sekvenser inom en Target mRNA (helst regioner som är fria från sekundär struktur), vilket gör möjligt mycket löst detektering av en avskrift. Den enda begränsningen vid antagande av denna teknik/protokoll för andra vävnader/celltyp…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Salvatore A.E. Marras (Public Health Research Institute Center, Rutgers University) för syntes, märkning och rening av molekylära beacons, och Daniel St Johnston (The Gurdon Institute, University of Cambridge) för Oskar-MS2/ MCP-GFP transgena flug bestånd. Detta arbete stöddes av en National Science Foundation CAREER Award 1149738 och en professionell personal kongress-CUNY Award till DPB.

Materials

Spectrofluorometer Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon n/a Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette Fireflysci (former Precision Cells Inc.) 701MFL
Dumont #5 tweezer World Precision Instruments 501985 Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898
Cover slip No.1 22 x 40mm VWR 48393-048
Dissecting microscope Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad Genesee Scienific 59-114
Tris-HCL pH7.5 Sigma-Aldrich 1185-53-1
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 7791-18-6
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
Spinning disc confocal microscope Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera Hamamatsu n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator Eppendorf Inc. 920000037
FemtoJet Microinjector Eppendorf Inc. 920010504
Injection needle: Femtotips II Eppendorf Inc. 930000043
Loading tip: 20ul Microloader Eppendorf Inc. 930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm VWR 48393-026; 48393-172
Dry yeast Any grocery store n/a
Computer, > 20 GB RAM Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
  2. Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).
  3. Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. Current techniques for visualizing RNA in cells. F1000Research. 5, (2016).
  4. Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
  5. Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
  6. Garcia, J. F., Parker, R. MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5′ to 3′ degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system. RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).
  7. Bratu, D. P. Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells. Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).
  8. Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).
  9. Tyagi, S., Kramer, F. R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).
  10. Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
  11. Liu, Y., et al. Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).
  12. Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).
  13. Ko, H. Y., et al. A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis. Scientific Reports. 4, 4626 (2014).
  14. Vet, J. A., et al. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).
  15. Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. Molecular beacons for protein-DNA interaction studies. Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).
  16. Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).
  17. Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells. Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).
  18. Ban, K., et al. Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4. Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).
  19. Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples. BMC Microbiology. 9, 97 (2009).
  20. McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).
  21. Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
  22. Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein. Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).
  23. Mhlanga, M. M., et al. In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte. PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).
  24. Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs. bioRxiv. , (2018).
  25. Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).
  26. Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection. Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).
  27. Dean, D. A. Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection. Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).
  28. Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
  29. Jackson, S. R., et al. Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells. Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).
  30. Zimyanin, V. L., et al. In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization. Cell. 134 (5), 843-853 (2008).
  31. Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. Tiny molecular beacons: LNA/2′-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells. ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).
  32. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).
  33. Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).
  34. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).
  35. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).
  36. Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
  37. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).
  38. Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
  39. Trcek, T., et al. Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters. Nature Commununications. 6, 7962 (2015).

Tags

MRNADrosophila MelanogasterEgg ChambersRNA LocalizationLive ImagingMolecular BeaconsMicroinjectionRNA BiologyReal-time VisualizationRNA TraffickingTherapeutic TargetsZebrafishCell CultureMicroscopyImage Analysis
check_url/58545?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers. J. Vis. Exp. (148), e58545, doi:10.3791/58545 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image