Visualizzazione e monitoraggio di mRNA endogeni nelle camere uovo di Drosophila melanogaster dal vivo
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la visualizzazione, il rilevamento, l’analisi e il monitoraggio del traffico di mRNA endogeno nel vivo Drosophila melanogaster camera d’uovo utilizzando fari molecolari, microscopia confocale del disco rotante, e analisi open-source software.
Abstract
Le tecniche di imaging basate sulla fluorescenza, in combinazione con gli sviluppi della microscopia luminosa, hanno rivoluzionato il modo in cui i biologi cellulari conducono studi di imaging a cellule vive. I metodi per rilevare gli RNA si sono notevolmente espansi a partire dagli studi seminali collegati alla localizzazione dell’mRNA specifico del sito alla regolazione dell’espressione genica. I processi dinamici dell’mRNA possono ora essere visualizzati tramite approcci che rilevano gli mRNA, associati a set-up di microscopia abbastanza veloci da catturare la gamma dinamica del comportamento molecolare. La tecnologia dei fari molecolari è un approccio basato sull’ibridazione in grado di rilevare direttamente le trascrizioni endogene nelle cellule viventi. I fari molecolari sono sonde di acido nucleico a forma di tornante, accoltellato internamente, mononucleotide, che fluoresce solo dall’ibridazione in una sequenza bersaglio unica. Quando accoppiati con la microscopia a fluorescenza avanzata e l’imaging ad alta risoluzione, consentono di eseguire il monitoraggio spaziale e temporale del movimento intracellulare degli mRNA. Anche se questa tecnologia è l’unico metodo in grado di rilevare le trascrizioni endogene, i biologi cellulari non hanno ancora pienamente abbracciato questa tecnologia a causa delle difficoltà nella progettazione di tali sonde per l’imaging delle cellule vive. Una nuova applicazione software, PinMol, consente una progettazione avanzata e rapida delle sonde più adatte per ibridarsi in modo efficiente alle regioni bersaglio mRNA all’interno di una cellula vivente. Inoltre, l’acquisizione di immagini ad alta risoluzione e in tempo reale e l’attuale software di analisi delle immagini open source consentono un output di dati raffinato, portando a una valutazione più fine della complessità alla base dei processi dinamici coinvolti nel ciclo di vita del mRNA.
Qui presentiamo un protocollo completo per la progettazione e la consegna di fari molecolari nelle camere d’uovo della Drosophila melanogaster. Il rilevamento e la visualizzazione diretta e altamente specifica di mRNA materni endogeni avviene tramite la microscopia confocale del disco rotante. I dati di imaging vengono elaborati e analizzati utilizzando il rilevamento e il rilevamento degli oggetti nel software Icy per ottenere dettagli sul movimento dinamico degli mRNA, che vengono trasportati e localizzati in regioni specializzate all’interno dell’oocito.
Introduction
Gli studi di biologia cellulare che visualizzano eventi dinamici con risoluzione spaziale e temporale sono stati resi possibili dallo sviluppo di tecniche di imaging delle cellule vive basate sulla fluorescenza. Attualmente, la visualizzazione mRNA in vivo si ottiene tramite tecnologie che si basano su interazioni RNA aptamer-proteina, fluorescenza indotta dall’RNA di coloranti organici e sonda dell’acido nucleico annealing1,2, 3. Tutti offrono un’elevata specificità, sensibilità e rapporto segnale-sfondo. Tuttavia, gli approcci centrati sull’RNA aptamer richiedono un’ampia manipolazione genetica, in cui un transgene è progettato per esprimere un RNA con motivi strutturali artificiali necessari per il legame di proteine o coloranti organici. Ad esempio, il sistema MS2/MCP richiede la co-espressione di un transgene che esprime un costrutto di RNA contenente più ripetizioni tandem della sequenza di legame per la proteina del pelo di batterifafo maMS2 (MCP) e un altro transgene che codifica una proteina fluorescente fusa in MCP4,5. L’aggiunta di tali motivi strutturali secondari all’RNA, insieme a una ingombrante proteina fluorescente, ha sollevato preoccupazioni sul fatto che i processi dell’RNA nativo possano essere influenzati6. Una tecnologia che affronta questa preoccupazione e offre ulteriori vantaggi unici è l’approccio basato sull’acido nucleico, i fari molecolari (MB). Gli MB consentono il rilevamento multiplex di mRNA endogeni, la discriminazione delle variazioni dei singoli nucleotidi e la cinetica veloce dell’ibridazione con mRNA bersaglio7,8. Gli MB sono sonde oligonucleotidi che rimangono in una prua spenta prima di subire un cambiamento conformazionale fluorogenico una volta ibridati ai loro obiettivi (Figura 1C)9. Diversi gruppi hanno avuto successo nell’utilizzo di MB per rilevare sia RNA non codificanti (microRNA e lncRNA)10,11,12,13, retrovirus RNA14 e DNA-protein dinamico interazioni15. Sono stati impiegati con successo per l’imaging in vari organismi e tessuti, come gli embrioni di pesce zebra16, i neuroni13, il tessuto tumorale17, differenziando i cardiomiociti18e la Salmonella 19.
Qui descriviamo l’approccio di progettazione, consegna e rilevamento per mRNA endogeni nelle camere d’uovo D. melanogaster viventi accoppiate con un set-up di microscopia che è abbastanza veloce per catturare la gamma dinamica del trasporto molecolare attivo. La camera d. melanogaster è servita come un sistema modello multicellulare ideale per una vasta gamma di studi sullo sviluppo, dalla divisione precoce delle cellule staminali germinali e l’espressione genica materna alla generazione del piano settoriale segmentale20, 21. Le camere delle uova sono facilmente isolate, grandi e traslucide e sono in grado di sopportare ore di analisi ex vivo, rendendole altamente suscettibili agli esperimenti di imaging. Molto lavoro si è concentrato sulla localizzazione asimmetrica delle trascrizioni materne in regioni subcellulari discrete prima di essere tradotte attivamente. In particolare, la localizzazione dell’oskar mRNA e la sua successiva traduzione al polo posteriore degli ovociti devono avvenire in modo strettamente regolamentato per evitare un fenotipo22di embrione biacaudale letale. oskar mRNA è trascritto nelle 15 cellule germinali, chiamate cellule infermiere, e trasportato attivamente attraverso ponti citoplasmici, chiamati ponti ad anello, nell’ovocita, la cellula germinale che diventa l’uovo maturo e viene infine fecondata (Figura 1A ). La notevole quantità di informazioni già disponibili per quanto riguarda il reclutamento dinamico e lo scambio di fattori proteici da e verso oskar mRNP, insieme ai suoi viaggi intracellulari a lungo raggio, rendono oskar un candidato preferito per studiare i numerosi processi del ciclo di vita dell’mRNA. Gli MB sono stati fondamentali per rivelare dettagli sul processo di localizzazione dell’mRNA e decifrare la regolazione e la funzione dei fattori proteici che controllano il trasporto dell’mRNA durante l’oogenesi della Drosophila. In particolare, microiniettando MB nelle cellule dell’infermiera ed eseguendo esperimenti di imaging in cellule vive, è possibile il monitoraggio degli mRNA endogeni8,23.
La tabella di marcia qui presentata offre le fasi di un processo completo, dall’esecuzione di un esperimento di imaging a cellule vive con manzi, acquisizione di dati di imaging, all’esecuzione di analisi dei dati per monitorare l’mRNA endogeno nel suo ambiente cellulare nativo. I passaggi possono essere modificati e ulteriormente ottimizzati per soddisfare le esigenze dei ricercatori che lavorano con altri tessuti / tipi di cellule all’interno del proprio ambiente di laboratorio.
Protocol
Representative Results
Discussion
La visualizzazione dal vivo del traffico endogeno di mRNA nelle camere delle uova della Drosophila si basa sull’uso di MB specifici, efficienti e resistenti alla nucasiera, che ora possono essere facilmente progettati con il software PinMol. Gli MB sono sonde specifiche progettate per rilevare sequenze univoche all’interno di un mRNA bersaglio (preferibilmente regioni prive di struttura secondaria), rendendo possibile il rilevamento altamente risolto di una trascrizione. L’unica limitazione quando si ad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Salvatore A.E. Marras (Public Health Research Institute Center, Rutgers University) per la sintesi, l’etichettatura e la purificazione dei fari molecolari, e Daniel St Johnston (The Gurdon Institute, Università di Cambridge) per l’oskar-MS2/ Stock di mosca transgenico MCP-GFP. Questo lavoro è stato sostenuto da un National Science Foundation CAREER Award 1149738 e da un Professional Staff Congress-CUNY Award al DPB.
Materials
| Spectrofluorometer | Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon | n/a | Photon counting spectrofluorometer |
| Quartz cuvette | Fireflysci (former Precision Cells Inc.) | 701MFL | |
| Dumont #5 tweezer | World Precision Instruments | 501985 | Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Cover slip No.1 22 x 40mm | VWR | 48393-048 | |
| Dissecting microscope | Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| CO2 fruit fly anesthesia pad | Genesee Scienific | 59-114 | |
| Tris-HCL pH7.5 | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Spinning disc confocal microscope | Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera | Hamamatsu | n/a | |
| PatchMan NP 2 Micromanipulator | Eppendorf Inc. | 920000037 | |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf Inc. | 920010504 | |
| Injection needle: Femtotips II | Eppendorf Inc. | 930000043 | |
| Loading tip: 20ul Microloader | Eppendorf Inc. | 930001007 | |
| Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm | VWR | 48393-026; 48393-172 | |
| Dry yeast | Any grocery store | n/a | |
| Computer, > 20 GB RAM | Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing |
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