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생물학

라이브 드로소필라 멜라노가스터 에그 챔버에서 내인성 mRNA 를 시각화하고 추적

Published: June 04, 2019
doi:
10.3791/58545
, , ,
1Biological Sciences Department Hunter College,City University of New York, 2Program in Molecular, Cellular, and Developmental Biology,Graduate Center, City University of New York

Summary

여기에서, 우리는 분자 비콘, 회전 디스크 공초점 현미경 및 오픈 소스 분석을 사용하여 살아있는 Drosophila melanogaster 계란 챔버에서 내인성 mRNA 인신 매매의 시각화, 탐지, 분석 및 추적을위한 프로토콜을 제시합니다. 소프트웨어.

Abstract

형광 기지를 둔 화상 진찰 기술은, 가벼운 현미경 검사법에 있는 발달과 조합하여, 세포 생물학자가 살아있는 세포 화상 진찰 연구 결과를 수행하는 방법 혁명을 일으켰습니다. RNA를 검출하는 방법은 정액 연구 결과 유전자 발현 규칙에 사이트 특정 mRNA 현지화를 연결하기 때문에 크게 확장되었습니다. 동적 mRNA 프로세스는 지금 분자 행동의 동적 범위를 포착하기 위하여 충분히 빠른 현미경 설치와 결합된 mRNA를 검출하는 접근을 통해 구상될 수 있습니다. 분자 비콘 기술은 살아있는 세포에서 내인성 전사체를 직접 검출할 수 있는 혼성화 기반 접근법이다. 분자 비콘은 헤어핀 모양, 내부적으로 담금질, 단일 뉴클레오티드 차별 핵산 프로브이며, 이는 독특한 표적 서열로 혼성화될 때만 형광됩니다. 고급 형광 현미경 검사법 및 고해상도 이미징과 결합할 때, 그들은 mRNA의 세포 내 움직임의 공간적 및 시간적 추적을 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 내인성 전사체를 검출할 수 있는 유일한 방법이지만, 세포 생물학자는 살아있는 세포 화상 진찰을 위한 그 같은 탐사기를 디자인하는 어려움 때문에 아직 완전히 이 기술을 받아들이지 않았습니다. 새로운 소프트웨어 애플리케이션인 PinMol은살아있는 세포 내의 mRNA 표적 영역을 효율적으로 혼성화하는 데 가장 적합한 프로브의 향상된 신속한 설계를 가능하게 합니다. 또한 고해상도, 실시간 이미지 수집 및 현재 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어를 통해 정교한 데이터 출력을 통해 mRNA의 수명 주기에 관련된 동적 프로세스의 복잡성을 보다 세밀하게 평가할 수 있습니다.

여기에서 우리는 Drosophila melanogaster 계란 약실에 분자 비콘을 디자인하고 전달하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 내인성 모계 mRNAs의 직접적이고 고도로 구체적인 검출 및 시각화는 회전 디스크 공초점 현미경 검사법을 통해 수행됩니다. 이미징 데이터는 Icy 소프트웨어에서 물체 감지 및 추적을 사용하여 처리및 분석되어 oocyte 내의 특수 영역으로 이송되고 국한되는 mRNA의 동적 움직임에 대한 세부 정보를 얻을 수 있습니다.

Introduction

공간적 및 시간적 해상도로 동적 이벤트를 시각화하는 세포 생물학 연구는 형광 기반 라이브 세포 이미징 기술의 개발에 의해 가능해졌습니다. 현재, 생체 내 mRNA 시각화는 RNA aptamer-단백질 상호 작용, 유기 염료 및 핵산 프로브어닐링 1,2의RNA aptamer 유도 형광에 기초한 기술을 통해 달성된다. 3. 그들은 모두 높은 특이성, 감도 및 신호 대 배경 비율을 제공합니다. 그러나 RNA aptamer 중심 접근법은 광범위한 유전자 조작을 필요로하며, 여기서 이식유전자는 단백질 또는 유기 염료 결합에 필요한 인공 구조 모티브로 RNA를 발현하도록 설계되었습니다. 예를 들어, MS2/MCP 시스템은 박테리오파지 MS2 코트 단백질(MCP)에 대한 결합 서열의 다중 탠덤 반복을 포함하는 RNA 구성을 발현하는 이식유전자의 공동 발현을 필요로 하며, 또 다른 이식유전자는 형광 단백질을 코딩한다. MCP4,5에융합 . 이러한 이차 구조 모티프를 RNA에 첨가하고, 부피가 큰 형광 태그가 붙은 단백질과 함께, 네이티브 RNA 과정이6에영향을 받을 수 있다는 우려를 제기하고 있다. 이러한 우려를 해결하고 추가적인 고유한 이점을 제공하는 기술은 핵산 기반 접근법인 분자 비콘(MBs)입니다. MBs는 내인성 mRNA의 다중 검출을 허용하고, 단일 뉴클레오티드 변이의 차별, 및표적 mRNA 7,8을가진 혼성화의 빠른 역학. MB는 그들의 표적에 혼성화되면 형광 형성 변화를 겪기 전에 담금질된 헤어핀 폴드에 남아 있는 올리고뉴클레오티드 프로브(도1C)9. 몇몇 단은 비코딩 RNA (microRNAs 및 lncRNAs)10,11,12,13,RNA 레트로바이러스14 및 동적 DNA 단백질을 둘 다 검출하기 위하여 MB를 사용하여 성공했습니다 상호 작용15. 그(것)들은 zebrafish 배아16,신경13,종양 조직17,분화 심근세포18및 살모넬라와 같은 각종 유기체 및 조직에서 화상 진찰을 위해 성공적으로 채택되었습니다 19.

여기에서 우리는 살아있는 D. melanogaster 계란 약실에 있는 내인성 mRNAs를 위한 디자인, 납품 및 검출 접근을 액티브한 분자 수송의 동적 범위를 붙잡기 위하여 충분히 빠른 현미경 설치와 결합된 기술합니다. D. melanogaster 계란 챔버는 초기 생식줄기 세포 분열 및 모계 유전자 발현에서 분절 체계획의 생성에 이르기까지 광범위한 발달 연구를 위한 이상적인 다세포 모델 시스템으로 작용하고 있다20, 21. 계란 챔버는 쉽게 분리, 크고 반투명, 그리고 생체 외 분석의 시간을 견딜 수, 그(것)들을 화상 진찰 실험에 높게 순종하. 많은 일은 적극적으로 번역되기 전에 이산 세포 지역에 모계 전사체의 비대칭 국소화에 초점을 맞추고있다. 특히, 오스카 mRNA 국소화 및 난모세포의 후방 극에서의 후속 번역은 치명적인 이카우드 배아 표현형22를피하기 위해 엄격하게 조절된 방식으로 발생되어야 한다. oskar mRNA는 간호사 세포에게 불린 15 생식선 세포에서 전사되고, 고리 운하에게 불린 세포질 다리를 통해서 능동적으로 수송됩니다, 난모세포로, 성숙한 계란이 되고 궁극적으로 기름지게 되는 생식세포 (그림1A ). oskar mRNP를 오가는 단백질 요인의 동적 모집 및 교환과 관련하여 이미 이용 가능한 상당한 양의 정보와 장거리 세포 내 여행이 있어 오스카를 연구하기에 선호되는 후보로 만듭니다. mRNA 수명 주기의 많은 프로세스. MBs는 mRNA 국소화의 과정에 관하여 세부사항을 드러내고 Drosophila 난소 생성 도중 mRNA 수송을 통제하는 단백질 요인의 규칙 그리고 기능을 해독하는 에서 중요한 역할을 했습니다. 특히, 간호사 세포에 MB를 마이크로주입하고 살아있는 세포 영상 실험을 수행함으로써, 내인성 mRNA의 추적이 8,23이가능하다.

여기에 제시된 로드맵은 MBs를 사용하여 라이브 셀 이미징 실험을 수행하고, 이미징 데이터를 획득하는 것에서부터 네이티브 셀룰러 환경에서 내인성 mRNA를 추적하기 위한 데이터 분석 수행에 이르기까지 완전한 프로세스의 단계를 제공합니다. 단계는 그들의 자신의 실험실 조정 내의 그밖 조직/세포 모형으로 일하는 연구원의 필요를 충족시키기 위하여 수정되고 추가 로 최적화될 수 있습니다.

Protocol

1. 라이브 셀 이미징을 위한 MB의 설계 표적 RNA 서열을 접어 mfold 서버로부터 “RNA 형태”를 사용하여 mRNA 표적의 이차 구조를 예측한다(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form). FASTA 형식으로 대상 시퀀스를 붙여 넣기/업로드하고, 5 또는 10% 하위 최적도(MFE 값의 5 또는 10% 이내로 접는 자유 에너지가 있는 구조)를 선택하고 그에 따라 계산된 폴딩의 최대 개수를 조?…

Representative Results

PinMol을사용하여, 여러 MB는 하나의 mRNA 표적을 위해 설계될 수 있다(도 1B-C). 합성 및 정제 후, 선택된 MB는 시험관내 분석을 사용하여 특징화되고 비교된다. 도 1: 내인성 mRNA의 살아있는 세포 화상 진찰을 위한 기술 및…

Discussion

Drosophila 계란 챔버에서 내인성 mRNA 인신 매매의 라이브 시각화는 이제 PinMol 소프트웨어로 쉽게 설계 할 수있는 특정, 효율적이고 뉴클레아제 내성 MBs의 사용에 의존합니다. MB는 표적 mRNA(바람직하게는 이차 구조가 없는 영역) 내에서 고유한 서열을 검출하도록 설계된 특정 프로브로서, 전사체의 고도로 해결된 검출이 가능하다. 다른 조직/세포 유형에 대해 이 기술/프로토콜을 채택할…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 합성, 라벨링 및 분자 비콘의 정화에 대한 살바토레 A.E. 마라스 (공중 보건 연구소 센터, 럿거스 대학) 감사, 다니엘 세인트 존스턴 (거든 연구소, 케임브리지 대학) 오스카-MS2 / MCP-GFP 형질 전환 플라이 스톡. 이 작품은 국립 과학 재단 경력 상 1149738 및 DPB에 전문 직원 의회 – CUNY 상에 의해 지원되었다.

Materials

Spectrofluorometer Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon n/a Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette Fireflysci (former Precision Cells Inc.) 701MFL
Dumont #5 tweezer World Precision Instruments 501985 Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898
Cover slip No.1 22 x 40mm VWR 48393-048
Dissecting microscope Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad Genesee Scienific 59-114
Tris-HCL pH7.5 Sigma-Aldrich 1185-53-1
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 7791-18-6
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
Spinning disc confocal microscope Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera Hamamatsu n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator Eppendorf Inc. 920000037
FemtoJet Microinjector Eppendorf Inc. 920010504
Injection needle: Femtotips II Eppendorf Inc. 930000043
Loading tip: 20ul Microloader Eppendorf Inc. 930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm VWR 48393-026; 48393-172
Dry yeast Any grocery store n/a
Computer, > 20 GB RAM Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing
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References

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Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers. J. Vis. Exp. (148), e58545, doi:10.3791/58545 (2019).
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