정화 및 체 외에서 활동 분석 결과 (p) ppGpp Clostridium 남과 어울리지 않 는에서 합성에 대 한
Summary
여기, 히스티딘 태그 pyrophosphokinase 효소 정화 및 radiolabelled 기질 그리고 효소 활동 체 외에 대 한 분석 결과를 제품의 얇은 층 크로마토그래피를 이용 하는 방법을 설명 합니다. 효소 활동 분석 결과 모든 키, 뉴클레오티드 있고, 또는 인광 체 전송 반응의 메커니즘 포함 뉴클레오티드 3 인산 염 가수분해에 광범위 하 게 적용 됩니다.
Abstract
키 및 pyrophosphokinase 효소 phosphorylated 제품을 기판에 뉴클레오티드 3 인산 염 선구자에서 감마 인산 염 또는 베타-감마 파이 인산 moiety를 전송. 사용 하는 γ-32-P NTP 선구자를 표시 하실 수 있습니다 방사선에 의해 기판 사용률 및 제품 대형의 동시 모니터링. 셀 룰 로스 판에 얇은 층 크로마토그래피 (TLC) 신속한 분리 및 기질과 제품의 민감한 정량화를 허용 한다. 우리는 얇은 층 크로마토그래피 정제 (p) ppGpp 합성의 pyrophosphokinase 활동 분석 결과를 활용 하는 방법을 제시. 이 방법은 주기적인 뉴클레오티드 및 디뉴클레오티드 synthetases의 활동 특성 사용 되었습니다 이전 이며 뉴클레오티드 3 인산 염 유대 hydrolyzes 또는 터미널 전송 하는 모든 효소의 활동을 특성화 하는 데 광범위 하 게 적합 인산 다른 분자를 염 인산 염 기증자 로부터
Introduction
키 및 pyrophosphokinase (또는 diphospho 키) 효소 기질 분자 뉴클레오티드 3 인산 염 (NTP) 선구자에서 인산 염을 전송. 기판 다른 뉴클레오티드, 아미노산 이나 단백질, 탄수화물, 그리고 지질1포함할 수 있습니다. 효소의 동족 기판 또는 특징이 효소를 유사성에 따라 기판 Bioinformatic 분석 예측 가끔 수 있습니다 하지만 실험 유효성 검사 여전히 필요 합니다. 마찬가지로, 그것의 substrate(s) 및는 그것 catalyzes 형광체 전송 반응 속도 효소의 선호도 및 공동 요인, 억제제, 또는 다른 효소 이펙터의 효과 결정 되어야 합니다 실험적으로. 다른 ATP 소모 효소 세균성 세포질에 존재에 의해 ATP 전조의 소모를 피하기 위해, 양적 활동 분석 실험 순화 된 단백질을 필요로 합니다.
단백질 정화 금속 친화성 크로마토그래피에 의해 문학2,3에 철저 하 게 적용 되었습니다 했습니다. 히스티딘 태그 6 연속 히스티딘 잔류물에는 N-또는 C-말단 재조합 단백질의 추가 구성 된 금속 친화성 크로마토그래피4,,56에 의해 급속 한 정화를 수 있습니다. 이러한 시퀀스는 작은 그들은 때로는 단백질 안정성 및 효소 반응 속도 론7,8변경할 수 있지만 그들은 수정 하 고 일반적으로 단백질 기능에 미치는 영향을 최소화 하는 단백질에 비해. 히스티딘 태그에는 N-와 C-테르미니 같은 단백질에 단백질의 구조를 알지 못하고 예측 하기 어려운 다양 한 효과 가질 수 있습니다. 히스티딘 태그는 일반적으로 복제는 재조합 형 단백질의 중 즉시 6 히스티딘 잔류물, 인코딩할 뇌관을 설계 하 여 3′ ATG 시작 codon에 또는 즉시 5′, 열려있는 독서 프레임 정지 codon를 하는 동안 통합 된다. 증폭 후 포함 하는 hexahistidine 유전자는 유도할 수 있는 발기인의 통제 벡터에 출혈 이며 표현 하는, 일반적으로 대장균의 실험실 긴장에. 재조합 단백질 다음 고정된 divalent 양이온 (일반적으로 니켈 또는 코발트)9를 포함 하는 선호도 수 지에 고립 될 수 있다. 기본 금속-바인딩 단백질 오염 하는 것은 이미, 경쟁적으로 바인딩된 단백질2배 수량으로 적정 하 여 제거할 수 있습니다. 마지막으로, 대상 단백질은 eluted 이미의 높은 농도와 열에서. 고정된 금속 양이온 수 지에 대 한 몇 가지 상용 소스 고 버퍼 조건 및 이미 농도 대 한 권장 사항을 제공 하는 제조 업체. 차입, 후 단백질 수 수 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 의해 분석, dialyzed, 또는 기능 분석에서 즉시 사용.
해제 또는 fluorophore는 흥분 하거나 생성 하는 화학, 두 번째 반응에 ATP 인산 염 결합 가수분해를 커플링 하 여 키 니 아 제 활동을 직접으로 모니터링 하는 여러 가지 방법이 있습니다 하지만이 반응은 여러 이동 부분 그리고 될 수 있는 물류 도전10. 특히 형광체 전송 활동을 측정 하는 가장 간단한 방법은 모니터링 하는 데 직접 상용 γ-32에서 방사선된 인산 염 그룹의 전송-P 비 방사선 기판11 에 NTP 전조 , 12 , 13. 방사선된 기판 및 제품의 혼합물을 분리 하 고 얇은 층 크로마토그래피 (TLC)에 의해 측정할 수 있다. TLC 용 매 (액체 단계) 모 세관 작용에 의해 표면 (단단한 단계)는 용액의 흡착된14되었습니다에서 마이그레이션할 수 있도록 하 여 주어진된 용 매에서 용액의 차동 이동성을 활용 합니다. 있는 작은 고체 단계와 호의 베푸는 상호 작용 부족 용액 마이그레이션됩니다 높은 분자 무게 또는 고체에 대 한 대단한 선호도 용액 보다 더 긴 거리 그들의 초기 위치에서. 인 전송의 시험, 인산 moieties 그들에, 추가 되 고 중성 또는 산 성 pH11,,1214에서 부정적인 이온 충전 추가 분자의 분자량 증가. 이 페이 셀 룰 로스 등 기본 표면에 그들의 기동성을 감소합니다. 신랄 한 칼륨 인산 염 버퍼에서 개발, 페이-셀 루 로스, 각 종 (그림 2, 그림 3)의 정량화를 허용에 모노, 디, 트라이-, tetra-및 pentaphosphate 종의 혼합물을 쉽게 분리 수 있다. 이러한 분석의 관심, 효소를 포함 하는 세포 lysates를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 하지만이 다른 kinases, 가수분해, 및 일반적인 ATPases의 활동에 대 한 잠재력을 고갈 기판 및/또는 제품을 포함 합니다. 평가 대 한 양적 체 외에서 효소 활동의, 그것은 관심의 효소 정화 해야 합니다.
Guanosine tetraphosphate (ppGpp) 및 guanosine pentaphosphate (pppGpp)는 ribonucleotide 신호 분자는 파이 인산의 이동에 의해 형성 된 그룹 아데노신 3 인산 염 (ATP) 전조에서 각각, guanosine diphosphate (GDP) 또는 guanosine tetraphosphate (GTP) 기판15. 이러한 단일 ribonucleotide 신호, (p) ppGpp로 총칭 알려진 다양 한 세균성 종15,16에 엄격한 응답으로 알려진 환경 스트레스에 셀 전체 응답 중재. 두 가지 보존된 수준의 효소 촉매 형성 (p) ppGpp15,17 Rel/Spo의 체 (RSH) 효소는 ‘긴’ bifunctional (p) ppGpp 합성/hydrolases 휴식 자리 (p)를 그들의 유사성에 대 한 명명 된 ppGpp 신진 대사 대장균 에서 합성, 가수분해 효소, 및 규제 도메인, 작은 alarmone (SAS) 합성 효소는 짧은 monofunctional synthetases 그램 긍정적인 박테리아15, 에서 독점적으로 포함 하는 효소 17 , 18. 포자 형성 그람 양성 박테리아 클로스 트리 남과 어울리지 않 는 putative RSH 및 SAS 유전자19인코딩합니다. 여기, 선물이 C. 남과 어울리지 않 는 RSH 효소 촉매로 활성 (p) ppGpp 합성 인지 확인 하는 초기 활동 분석 실험.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기 우리가 보고 그의 태그 RSH C. 남과 어울리지 않 는에서 정화 활동 정량화 방사선된 얇은 층 착 색 인쇄기를 사용 하 여에 대 한 방법을 제시 하 고. 이 방법은 이전 C. 남과 어울리지 않는로 (p) ppGpp 합성, 뉴클레오티드 있고, 키 니 아 제 diguanylate 있고 효소와 다른 유기 체11,12 포스 효소의 활동을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. ,</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIAID 1K22AI118929-01에 의해 투자 되었다. EBP는 오래 된 판도 대학 노퍽, 버지니아, 미국에서 연구의 사무실에서 여름 연구 친교 프로그램 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Inducible overexpression of a histidine-tagged protein | |||
| Phusion polymerase | New England Biolabs (NEB) | M0530L | |
| QIAEX II DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| KpnI restriction enzyme | NEB | R0142S | |
| PstI restriction enzyme | NEB | R0140S | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987I | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | NEB | C2527I | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | 10724815001 | |
| JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor | Beckman Coulter Avanti | – | |
| Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor | Scilogex | – | |
| MaxQ SHKE6000 Incubator | Thermo Scientific | – | |
| Ultrasonic processor | Sonics | VC-750 | |
| Protein purification by nickel affinity chromatography | |||
| Ni-NTA resin | G Biosciences | 786-940/941 | |
| Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL | Thermo Scientific | 29924 | |
| 1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) | Spectrum | G235033 | |
| Mini-Protean Electrophoresis Cell | BioRad | 1658004 | |
| Protein activity assay by thin layer chromatography | |||
| Thin layer chromatograph (TLC) development tank | General Glass Blowing Company | 80-3 | |
| Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support | Sigma-Aldrich | Z122882-25EA | |
| ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi | Perkin Elmer | NEG002A | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM | Bio Basic Canada | AB0311 | |
| Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) | Alfa Aesar | AAJ61646MC/E | |
| Storage phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen | |
| Storm 860 phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | – |
References
- Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases. BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).
- Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).
- Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags. Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).
- Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins. Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).
- Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
- Booth, W. T., et al. Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability. ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).
- Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics. 생화학. 50 (25), 5799-5805 (2011).
- Chaga, G. S. Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).
- Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization. Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).
- Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase. Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).
- Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile. Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).
- Purcell, E. B., Tamayo, R. Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases. Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).
- Ross, P., et al. Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase. Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).
- Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical?. Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
- Boutte, C. C., Crosson, S. Bacterial lifestyle shapes stringent response activation. Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).
- Nanamiya, H., et al. Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).
- Gaca, A. O., et al. Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response. mBio. 4 (5), (2013).
- Sebaihia, M., et al. The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome. Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).
- Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
- Purcell, E. B., et al. A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase. Infection and Immunity. , (2017).
- Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis. Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).
- Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).
- Bartlett, J. G. Clostridium difficile: progress and challenges. Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).
- . . US Department of Health and Human Services. , (2013).
