Uma purificação e ensaio de atividade In Vitro para um ppGpp (p) sintetase de Clostridium difficile

Summary

Aqui, descrevemos um método para a purificação de enzimas pyrophosphokinase histidina-tag e utilizando cromatografia em camada fina dos produtos a ensaiar para a atividade enzimática em vitroe substratos marcadas com radioisótopos. O ensaio da atividade da enzima é amplamente aplicável a quinase, ciclase nucleotídeo ou reação de transferência de fósforo, cujo mecanismo inclui a hidrólise de nucleotídeos trifosfato.

Abstract

Quinase e pyrophosphokinase enzimas transferir o fosfato gama ou a fracção de pirofosfato de beta-gama de precursores de nucleotídeo trifosfato para substratos para criar produtos fosforilados. O uso de γ –³²– P rotulado precursores NTP permite a monitorização simultânea de formação de produto e utilização de substrato por radiografia. Cromatografia em camada fina (TLC) em placas de celulose permite a separação rápida e sensível quantificação do substrato e produto. Apresentamos um método para a utilização da cromatografia de camada fina para analisar a atividade de pyrophosphokinase de uma sintetase de ppGpp purificado (p). Este método anteriormente foi usado para caracterizar a atividade de sintetases nucleotídeo e dinucleótido cíclicas e é amplamente apropriado para caracterizar a atividade de uma enzima que hidrolisa um vínculo de trifosfato de nucleotídeos ou transfere um terminal fosfato de um doador de fosfato para outra molécula.

Introduction

Quinase e pyrophosphokinase (ou diphospho-quinase) enzimas transferir fosfatos de precursores de nucleotídeo trifosfato (NTP) para as moléculas do substrato. Os substratos podem incluir outros nucleotídeos, aminoácidos ou proteínas, carboidratos e lipídios¹. Análises de Bioinformatic às vezes podem prever de uma enzima cognato substrato ou substratos com base na similaridade de enzimas caracterizadas, mas validação experimental ainda é necessária. Da mesma forma, a afinidade de uma enzima para sua substrate(s) e a taxa na qual ele catalisa a reação de transferência de fósforo e os efeitos de co-fatores, inibidores ou outros efetores da enzima devem ser determinado experimentalmente. Para evitar o esgotamento do precursor ATP por outras consumidores de ATP enzimas presentes no citoplasma bacteriana, ensaios de atividade quantitativa exigem proteína purificada.

Purificação de proteínas por cromatografia de afinidade metal tem sido coberta completamente na literatura^2,3. Tags de histidina, consistindo de seis resíduos de histidina consecutivos anexados a N – ou C-terminal de uma proteína recombinante permitir rápida purificação por cromatografia de afinidade metal^4,5,6. Essas sequências são pequenas em comparação com as proteínas que eles modificar e geralmente têm um efeito mínimo na função da proteína, embora às vezes eles podem alterar a estabilidade da proteína e/ou cinética de enzima^7,8. Etiquetas de histidina na N – e C-termini da mesma proteína podem ter efeitos diferentes, que são difíceis de prever sem conhecer a estrutura da proteína em questão. Etiquetas de histidina normalmente são incorporadas durante a clonagem de uma proteína recombinante por projetar primers que codificam seis resíduos de histidina, também imediatamente 3′ para o códon de início ATG ou imediatamente 5′ para o códon de parada do quadro de leitura aberto. Após amplificação, o gene contendo hexahistidine é ligado em um vetor sob o controle de um promotor inducible e expresso, normalmente em um laboratório cepa de e. coli. Então, a proteína de recombinação pode ser isolada em uma resina de afinidade que contém cátions divalentes imobilizado (normalmente níquel ou cobalto)⁹. Contaminar as proteínas de ligação de metal nativas pode ser removido por titulação com imidazol, que competitivamente desloca limite da proteína². Finalmente, a proteína alvo é eluída da coluna com concentrações mais altas de imidazol. Existem várias fontes comerciais para resinas de cátion de metal imobilizado, e os fabricantes fornecem recomendações para as condições de reserva e concentrações de imidazol. Após a eluição, proteína pode ser analisada por eletroforese em gel polyacrylamide do sulfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE), diálise ou usada imediatamente em ensaios funcionais.

Existem vários métodos para monitorar indiretamente a atividade da quinase pelo acoplamento de hidrólise de ligação de fosfato de ATP para uma segunda reação que libera ou excita um fluoróforo ou gera quimioluminescência, mas estas reações possuem várias partes móveis e podem ser logisticamente desafiadoras¹⁰. A maneira mais simples para medir especificamente a atividade de transferência de fósforo é diretamente monitorar a transferência de um grupo fosfato radiolabeled de um γ comercialmente disponível –³²-P precursor do NTP para um substrato não-radiolabeled^{11 , 12 , 13}. as misturas de substratos radiolabeled e produtos podem ser separadas e quantificadas por cromatografia de camada fina (TLC). TLC utiliza a mobilidade diferencial de solutos em um determinado solvente, permitindo que o solvente (fase líquida) a migrar por acção capilar através de uma superfície (fase sólida) no qual uma mistura de solutos tem sido adsorvida¹⁴. Solutos que são pequenas e/ou faltam de interações favoráveis com a fase contínua irão migrar longas distâncias da sua localização inicial do que solutos com maiores pesos moleculares ou grande afinidade para o sólido. Para exame de transferência de fósforo, metades de fosfato aumentam o peso molecular das moléculas são adicionados a eles e adicionar carga iônica negativa em pH neutro ou ácido^11,12,14. Isso diminui sua mobilidade em uma superfície básica como PEI-celulose. Quando desenvolvido em tampão de fosfato ácido de potássio, misturas de mono-, di-, tri-, tetra- e espécies de pentaphosphate podem ser facilmente separadas na PEI-celulose, permitindo a quantificação de cada espécie (Figura 2, Figura 3). Tais ensaios podem ser executados usando lisados celulares contendo a enzima de interesse, mas isso inclui o potencial para a atividade de outros quinases e fosfatases ATPase geral para esgotar o substrato e/ou produto. Para uma avaliação quantitativa em vitro da atividade da enzima, é necessário purificar a enzima de interesse.

Hexaetilo de guanosina (ppGpp) e guanosina pentaphosphate (pppGpp) são ribonucleótido sinalização moléculas formadas pela transferência de um pirofosfato de grupo de um precursor de trifosfato de adenosina (ATP), respectivamente, um guanosina difosfato (PIB) ou guanosina (GTP) de hexaetilo substrato¹⁵. Estes sinais ribonucleótido único, coletivamente conhecidos como ppGpp (p), mediam uma resposta de toda a célula ao estresse ambiental, conhecido como a resposta rigorosa em diversas espécies bacterianas^15,16. Duas classes conservadas de enzimas catalisam a formação de (p) ppGpp^15,17 Rel/Spo homólogo (RSH) enzimas são ‘longo’ bifuncional (p) ppGpp sintetase/hidrolases chamado por sua semelhança com o real e o ponto (p) ppGpp metabólica enzimas de Escherichia coli que contêm sintetase, hidrolase e domínios normativos, enquanto pequenas alarmone sintetase (SAS) enzimas são curto monofuncionais sintetases encontradas exclusivamente no Gram positivo bactérias^{15, 17 , 18}. a bactéria Gram-positiva formadoras de esporos Clostridium difficile codifica putativo RSH e SAS genes¹⁹. Aqui, apresentamos os ensaios de atividade inicial que confirmam que a enzima de c. difficile RSH é uma sintetase de ppGpp cataliticamente ativo (p).

Protocol

1. inducible superexpressão de uma proteína Histidine-tag Amplifica o rsh de c. difficile R20291 DNA genômico. Use um polymerase de alta-fidelidade e siga as instruções do fabricante. Amplificar a c. difficile rsh usando as primeiras demãorsh_F (GGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG deGGTACCde CA) ersh_R (CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC), que introduz uma marca de hexahistidine do C-terminal.Nota: O KpnI e…

Representative Results

Apresentamos um método para a purificação da afinidade de uma sintetase do ppGpp (p) de Clostridium difficile e a avaliação da sua actividade enzimática. A Figura 1 demonstra a purificação de proteínas, obtida por cromatografia de afinidade de metal. A segunda fração de eluição (E2) desta purificação foi diálise e utilizada para o ensaio de atividade enzimática. A Figura 2 detalha as etapas necessárias …

Discussion

Aqui nós relatamos a purificação do RSH com sua Tag de c. difficile e apresentar um método para a quantificação de atividade usando cromatografia em camada fina radiolabeled. Este método foi usado anteriormente para avaliar a atividade das enzimas de ciclase diguanylate de c. difficile, bem como sintetase do ppGpp (p), ciclase de nucleotídeos, quinase e enzimas fosfodiesterase de outros organismos^{11,12 ,13</…}

Materials

Inducible overexpression of a histidine-tagged protein
Phusion polymerase	New England Biolabs (NEB)	M0530L
QIAEX II DNA Gel Extraction Kit	Qiagen	20021
KpnI restriction enzyme	NEB	R0142S
PstI restriction enzyme	NEB	R0140S
T4 DNA ligase	NEB	M0202
NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency)	NEB	C2987I
BL21 (DE3) Competent E. coli	NEB	C2527I
IPTG	Sigma-Aldrich	10724815001
JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor	Beckman Coulter Avanti	–
Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor	Scilogex	–
MaxQ SHKE6000 Incubator	Thermo Scientific	–
Ultrasonic processor	Sonics	VC-750
Protein purification by nickel affinity chromatography
Ni-NTA resin	G Biosciences	786-940/941
Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL	Thermo Scientific	29924
1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD)	Spectrum	G235033
Mini-Protean Electrophoresis Cell	BioRad	1658004
Protein activity assay by thin layer chromatography
Thin layer chromatograph (TLC) development tank	General Glass Blowing Company	80-3
Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support	Sigma-Aldrich	Z122882-25EA
ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi	Perkin Elmer	NEG002A
Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM	Bio Basic Canada	AB0311
Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP)	Alfa Aesar	AAJ61646MC/E
Storage phosphor screen	GE Healthcare Life Sciences	BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen
Storm 860 phosphorimager	GE Healthcare Life Sciences	–