Una purificazione e l'analisi di attività In Vitro per un ppGpp (p) sintetasi da Clostridium difficile
Summary
Qui, descriviamo un metodo per purificare enzimi pyrophosphokinase istidina-etichettate e utilizzando la cromatografia su strato sottile di radiomarcato substrati e prodotti di test per l’ attività enzimatica in vitro. L’analisi di attività dell’enzima è ampiamente applicabile a qualsiasi chinasi, ciclasi del nucleotide o reazione di fosforo-trasferimento cui meccanismo include idrolisi di trifosfato del nucleotide.
Abstract
Gli enzimi della chinasi e pyrophosphokinase trasferire la gamma fosfato o la frazione di pirofosfato di beta-gamma dai precursori di nucleotide trifosfato ai substrati per creare prodotti fosforilati. L’uso di γ –32– P etichettato precursori NTP permette monitoraggio simultaneo della formazione di prodotto e l’utilizzo di substrato dalla radiografia. Cromatografia su strato sottile (TLC) su piastrine di cellulosa consente la rapida separazione e quantificazione sensibile del substrato ed il prodotto. Presentiamo un metodo per utilizzando la cromatografia di strato sottile per analizzare l’attività pyrophosphokinase di una purificato sintetasi di ppGpp (p). Questo metodo è stato utilizzato in precedenza per caratterizzare l’attività della sintetasi del nucleotide e dinucleotide ciclici ed è ampiamente adatto per caratterizzare l’attività di ogni enzima che idrolizza un legame di nucleotide trifosfato o trasferisce un terminale fosfato da un donatore di fosfato ad un’altra molecola.
Introduction
Gli enzimi della chinasi e pyrophosphokinase (o membrana in direzione extra-chinasi) trasferimento fosfati dai precursori di nucleotide trifosfato (NTP) per molecole substrato. I substrati possono includere altri nucleotidi, aminoacidi o proteine, carboidrati e lipidi1. Analisi bioinformatiche talvolta possono prevedere un enzima substrato affine o substrati basate sulla somiglianza agli enzimi caratterizzati, ma convalida sperimentale è ancora necessario. Allo stesso modo, l’affinità di un enzima per la sua overesprimessero e la velocità che esso catalizza la reazione di trasferimento di fosforo e gli effetti della co-fattori, inibitori, o altri effettori enzima devono essere determinati sperimentalmente. Per evitare lo svuotamento del precursore ATP da altri enzimi che consumano ATP presenti nel citoplasma batterico, analisi quantitativa attività richiedono proteina purificata.
Purificazione della proteina di cromatografia di affinità del metallo è stato coperto accuratamente in letteratura2,3. Tag di istidina composto da residui di istidina consecutivi sei accodati a N – o C-terminale di una proteina ricombinante consentono la rapida purificazione da cromatografia di affinità del metallo4,5,6. Queste sequenze sono piccole rispetto alle proteine modificano e in genere hanno un effetto minimo sulla funzione della proteina, anche se a volte possono alterare stabilità proteica e/o enzima cinetica7,8. Istidina Tag presso il N – e C-termini della stessa proteina può avere effetti differenti, che sono difficili da prevedere senza conoscere la struttura della proteina in questione. Tag di istidina sono incorporati in genere durante la clonazione di una proteina ricombinante di progettazione degli iniettori che codificano sei residui di istidina, sia immediatamente il codone di inizio ATG a 3′ o immediatamente 5′ per il codone di arresto del telaio di lettura aperto. Dopo l’amplificazione, il gene hexahistidine-contenenti è legato in un vettore sotto il controllo di un promotore inducibile ed espressa, in genere in un ceppo di laboratorio di e. coli. La proteina di ricombinazione può quindi essere isolata su una resina di affinità contenente cationi bivalenti immobilizzato (tipicamente nichel o cobalto)9. Contaminando native proteine metallo-leganti possa essere rimossi mediante titolazione con imidazolo, che sposta competitivi associata proteina2. Infine, la proteina dell’obiettivo è eluita dalla colonna con concentrazioni più elevate di imidazolo. Ci sono diverse fonti commerciali per resine immobilizzato catione del metallo, e i produttori forniscono raccomandazioni per le condizioni di buffer e le concentrazioni dell’imidazolo. Dopo eluizione, proteina può essere analizzata mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE), dializzata o usata immediatamente in saggi funzionali.
Ci sono diversi metodi per monitorare indirettamente l’attività della chinasi di idrolisi dell’ATP fosfato legame di accoppiamento a una seconda reazione che rilascia o eccita un fluoroforo o genera chemiluminescenza, ma queste reazioni hanno più parti mobili e possono essere logisticamente impegnativo10. Il modo più semplice per misurare specificamente l’attività di fosforo-trasferimento è per monitorare direttamente il trasferimento di un gruppo fosfato radioattivo da un commercialmente disponibili γ –32-P precursore NTP di un substrato non-radioattivi11 , 12 , 13. miscele di substrati radioattivi e i prodotti possono essere separate e quantificate mediante cromatografia su strato sottile (TLC). TLC utilizza la mobilità differenziale di soluti in un dato solvente consentendo il solvente (fase liquida) eseguire la migrazione di azione capillare attraverso una superficie (fase solida) su cui una miscela di soluti è stato adsorbito14. Soluti che sono piccole e/o mancano di interazioni favorevoli con la fase solida migrerà distanze più lunghe dalla loro posizione iniziale del soluti con pesi molecolari superiori o grande affinità per il solido. Per l’esame di fosforo-trasferimento, moiety fosfato aumentare il peso molecolare delle molecole vengono aggiunti a e aggiungere carica ionica negativa a pH neutro o acido11,12,14. Questo diminuisce la loro mobilità su una superficie di base quali PEI-cellulosa. Quando sviluppate in tampone fosfato acido di potassio, miscele di mono-, di-, tri-, tetra-e pentaphosphate specie possono essere facilmente separate su PEI-cellulosa, consentendo la quantificazione di ogni specie (Figura 2, figura 3). Tali dosaggi possono essere eseguite utilizzando lisati cellulari contenenti l’enzima di interesse, ma questo include il potenziale per l’attività di altre chinasi e fosfatasi ATPasi generale per vuotare il substrato e/o prodotto. Per una valutazione quantitativa in vitro dell’attività dell’enzima, è necessario purificare l’enzima di interesse.
Tetrafosfato di guanosina (ppGpp) e guanosina pentaphosphate (pppGpp) sono ribonucleotide di segnalazione molecole formate dal trasferimento di un pirofosfato di gruppo da un precursore di adenosina trifosfato (ATP) a, rispettivamente, un guanosina difosfato (GDP) o guanosina tetrafosfato (GTP) substrato15. Questi segnali di singolo ribonucleotide, collettivamente conosciuti come ppGpp (p), mediano una risposta cellulare allo stress ambientale, conosciuta come la risposta rigorosa in diverse specie batteriche15,16. Conservate due classi di enzimi catalizzano la formazione di (p) ppGpp15,17 Rel/Spo omologo (RSH) enzimi sono ‘lungo’ bifunzionale (p) ppGpp sintetasi/idrolasi denominato per la loro somiglianza con le relazioni ed il punto (p) ppGpp metabolica enzimi da Escherichia coli che contengono sintetasi, idrolasi e regolamentazione domini, mentre piccole alarmone sintetasi (SAS) gli enzimi sono breve monofunzionale sintetasi trovati esclusivamente a Gram positivi batteri15, 17 , 18. il batterio gram-positivo sporigeni Clostridium difficile codifica putativi geni RSH e SAS19. Qui, presentiamo analisi di attività iniziale che confermano che l’enzima di c. difficile RSH è una cataliticamente attiva sintetasi di ppGpp (p).
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui segnaliamo la purificazione della sua etichetta RSH da c. difficile e presentare un metodo per la quantificazione di attività mediante cromatografia su strato sottile radiomarcato. Questo metodo è stato utilizzato in precedenza per valutare l’attività di enzimi ciclasi diguanylate da c. difficile, come pure della sintetasi di ppGpp (p), ciclasi del nucleotide, chinasi ed enzimi fosfodiesterasi da altri organismi11,12 ,<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal NIAID 1K22AI118929-01. EBP è stata sostenuta da una sovvenzione di programma estate Research Fellowship dall’Office of Research presso Old Dominion University, Norfolk, Virginia, USA.
Materials
| Inducible overexpression of a histidine-tagged protein | |||
| Phusion polymerase | New England Biolabs (NEB) | M0530L | |
| QIAEX II DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| KpnI restriction enzyme | NEB | R0142S | |
| PstI restriction enzyme | NEB | R0140S | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987I | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | NEB | C2527I | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | 10724815001 | |
| JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor | Beckman Coulter Avanti | – | |
| Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor | Scilogex | – | |
| MaxQ SHKE6000 Incubator | Thermo Scientific | – | |
| Ultrasonic processor | Sonics | VC-750 | |
| Protein purification by nickel affinity chromatography | |||
| Ni-NTA resin | G Biosciences | 786-940/941 | |
| Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL | Thermo Scientific | 29924 | |
| 1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) | Spectrum | G235033 | |
| Mini-Protean Electrophoresis Cell | BioRad | 1658004 | |
| Protein activity assay by thin layer chromatography | |||
| Thin layer chromatograph (TLC) development tank | General Glass Blowing Company | 80-3 | |
| Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support | Sigma-Aldrich | Z122882-25EA | |
| ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi | Perkin Elmer | NEG002A | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM | Bio Basic Canada | AB0311 | |
| Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) | Alfa Aesar | AAJ61646MC/E | |
| Storage phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen | |
| Storm 860 phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | – |
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