Une Purification et analyse d’activité In Vitro pour un (p) ppGpp synthétase de Clostridium difficile
Summary
Nous décrivons ici une méthode pour la purification des enzymes pyrophosphokinase histidine-étiquetées et utilisant la chromatographie sur couche mince des substrats radiomarqués et produits pour le dosage de l’ activité enzymatique in vitro. Le dosage de l’activité enzymatique est largement applicable aux kinase, cyclase de nucléotides ou réaction de transfert de phosphore dont le mécanisme comprend l’hydrolyse de nucléotides triphosphate.
Abstract
Enzymes kinases et pyrophosphokinase transférer le phosphate gamma ou la portion de pyrophosphate de bêta-gamma de précurseurs de nucléotides triphosphate de substrats pour créer des produits phosphorylés. L’utilisation de γ –32– P étiqueté précurseurs NTP permet une surveillance simultanée de formation utilisation et produit de substrat par radiographie. Chromatographie sur couche mince (TLC) sur des plaques de cellulose permet une séparation rapide et sensible quantification du substrat et produit. Nous présentons une méthode pour l’utilisation de la chromatographie en couche mince pour doser l’activité pyrophosphokinase d’un (p) ppGpp synthétase purifiée. Cette méthode n’a encore été utilisée pour caractériser l’activité des synthétases cycliques de nucléotide et dinucléotide et est largement adaptée pour caractériser l’activité d’une enzyme qui hydrolyse d’une liaison de triphosphate de nucléotides ou transfère un terminal phosphate d’un donneur de phosphate à une autre molécule.
Introduction
Les enzymes kinases et pyrophosphokinase (ou diphospho-kinase) transfert en phosphates de précurseurs de nucléotides triphosphates (NTP) aux molécules de substrat. Les substrats peuvent inclure les autres nucléotides, des acides aminés ou protéines, glucides et lipides1. Analyses bioinformatiques peuvent parfois prévoir une enzyme substrat apparenté ou substrats fondées sur la similitude aux enzymes caractérisées, mais il faut toujours une validation expérimentale. De même, l’affinité de l’enzyme pour sa fonction et le taux auquel elle catalyse la réaction de transfert de phosphore et les effets des co-facteurs, inhibiteurs, ou autres effecteurs de l’enzyme doivent être déterminées expérimentalement. Afin d’éviter l’appauvrissement du précurseur ATP des autres enzymes ATP consommateurs présents dans le cytoplasme bactérien, tests d’activité quantitative nécessitent de protéine purifiée.
Purification des protéines par chromatographie d’affinité métallique a été couvert abondamment dans la littérature2,3. Les balises de histidine consistant en six résidus histidine consécutives annexées à l’extrémité N – ou C-terminale d’une protéine recombinante permettent rapide purification par affinité métallique chromatographie4,5,6. Ces séquences sont petites par rapport aux protéines ils modifier et ont généralement un effet minime sur la fonction des protéines, bien qu’ils peuvent parfois modifier stabilité des protéines et/ou enzyme cinétique7,8. Histidine balises aux N – et C-terminus de la protéine même peuvent avoir des effets différents, qui sont difficiles à prédire sans connaître la structure de la protéine en question. Tags de l’histidine sont généralement incorporés pendant le clonage d’une protéine recombinante en concevant des amorces qui codent pour six résidus histidine, soit immédiatement 3′ pour le codon de début ATG ou juste 5′ pour le codon d’arrêt de la trame de lecture ouverte. Après amplification, le gène de la protéine contenant est ligué dans un vecteur sous le contrôle d’un promoteur inductible et exprimé, en général chez une souche de laboratoire d’Escherichia coli. Les protéines de recombinaison peuvent ensuite être isolé sur une résine contenant des cations divalents immobilisé (typiquement de nickel ou de cobalt)9. Contamination des protéines liant le métal natifs peut être enlevé par titrage avec imidazole, qui déplace compétitif lié protein2. Enfin, la protéine-cible est éluée de la colonne avec des concentrations plus élevées de l’imidazole. Il y a plusieurs sources commerciales pour les résines de cations métalliques immobilisés et les constructeurs fournissent des recommandations pour les conditions de la mémoire tampon et les concentrations en imidazol. Après élution, protéine peut être analysé par électrophorèse sur gel sodium dodecyl sulfate polyacrylamide (SDS-PAGE), dialysée ou utilisé immédiatement pour des tests fonctionnels.
Il existe plusieurs méthodes pour contrôler indirectement l’activité kinase en couplant l’hydrolyse des liaisons phosphate de l’ATP à une seconde réaction qui libère ou excite un fluorophore ou génère la chimiluminescence, mais ces réactions ont les pièces mobiles multiples et peuvent être logistiquement difficile10. La façon la plus simple pour mesurer plus précisément l’activité de phosphore-transfert doit directement surveiller le transfert d’un groupement phosphate radiomarqué d’un disponible dans le commerce γ –32P – précurseur NTP à un substrat non radioactif11 , 12 , 13. mélanges de substrats radiomarquées et produits peuvent être séparés et quantifiés par chromatographie sur couche mince (CCM). TLC utilise la mobilité différentielle des solutés dans un solvant donné en permettant le solvant (phase liquide) migrer par capillarité à travers une surface (phase solide) sur lequel un mélange de solutés a été adsorbé14. Les solutés qui sont de petite taille ou les interactions favorables avec la phase solide vont migrer plus longues distances de leur emplacement initial que les solutés avec un poids moléculaire plus élevé ou de grande affinité pour le solide. Pour l’examen du transfert de phosphore, groupements phosphate augmentent le poids moléculaire des molécules, ils sont ajoutés à et ajouter la charge ionique négative à pH neutre ou acide11,12,14. Cela diminue leur mobilité sur une surface de base tels que la PEI-cellulose. Quand développé dans un tampon phosphate acide de potassium, mélanges de mono-, di-, tri-, tétra- et pentaphosphate espèces peuvent être aisément séparées sur PEI-cellulose, ce qui permet la quantification de chaque espèce (Figure 2, Figure 3). Ces tests peuvent être effectuées à l’aide de lysats de cellules contenant l’enzyme d’intérêt, mais cela inclut la possibilité pour l’activité d’autres kinases et phosphatases ATPases générales pour épuiser le substrat ou le produit. Pour une évaluation quantitative in vitro de l’activité enzymatique, il faut purifier l’enzyme d’intérêt.
Guanosine tétraphosphate (ppGpp) et la guanosine pentaphosphate (pppGpp) sont des ribonucléotides signalisation des molécules formées par le transfert d’un pyrophosphate de groupe d’un précurseur de l’adénosine triphosphate (ATP), respectivement, un diphosphate de guanosine (PIB) ou guanosine tétraphosphate (GTP) substrat15. Ces signaux de ribonucléotide unique, collectivement connus comme (p) ppGpp, véhiculent une réponse à l’échelle de la cellule à un stress environnemental connu comme la réponse stricte dans diverses espèces bactériennes15,16. Deux classes conservées des enzymes catalysent la formation de (p) ppGpp15,17 Rel/Spo enzymes homologue (RSH) sont « long » bifonctionnel (p) ppGpp synthétase/hydrolases nommé pour leur ressemblance avec la RelA et SpoT (p) ppGpp métabolique enzymes d’Escherichia coli qui contiennent synthétase, hydrolase et domaines réglementaires, tandis que les petites alarmone synthétase (SAS) enzymes sont courts monofonctionnel synthétases trouvés exclusivement à Gram positif bactéries15, 17 , 18. la bactérie Gram-positive sporulée Clostridium difficile encode putatif RSH et SAS gènes19. Nous présentons ici les tests d’activité initial qui confirment que l’enzyme RSH de c. difficile est un catalytiquement actifs (p) ppGpp synthétase.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous rapportons ici la purification de son étiquette RSH de c. difficile et présenter une méthode de quantification de l’activité à l’aide de la chromatographie sur couche mince radiomarqué. Cette méthode a déjà été utilisée pour évaluer l’activité des enzymes cyclase diguanylate de c. difficile, ainsi que (p) ppGpp synthétase, adénylcyclase nucléotide kinase et enzymes de phosphodiestérase d’autres organismes11,12 <su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par le NIAID 1K22AI118929-01. EBP était soutenu par une subvention du programme Summer recherche Fellowship de l’Office of Research à Old Dominion University, Norfolk, Virginia, USA.
Materials
| Inducible overexpression of a histidine-tagged protein | |||
| Phusion polymerase | New England Biolabs (NEB) | M0530L | |
| QIAEX II DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| KpnI restriction enzyme | NEB | R0142S | |
| PstI restriction enzyme | NEB | R0140S | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987I | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | NEB | C2527I | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | 10724815001 | |
| JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor | Beckman Coulter Avanti | – | |
| Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor | Scilogex | – | |
| MaxQ SHKE6000 Incubator | Thermo Scientific | – | |
| Ultrasonic processor | Sonics | VC-750 | |
| Protein purification by nickel affinity chromatography | |||
| Ni-NTA resin | G Biosciences | 786-940/941 | |
| Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL | Thermo Scientific | 29924 | |
| 1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) | Spectrum | G235033 | |
| Mini-Protean Electrophoresis Cell | BioRad | 1658004 | |
| Protein activity assay by thin layer chromatography | |||
| Thin layer chromatograph (TLC) development tank | General Glass Blowing Company | 80-3 | |
| Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support | Sigma-Aldrich | Z122882-25EA | |
| ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi | Perkin Elmer | NEG002A | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM | Bio Basic Canada | AB0311 | |
| Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) | Alfa Aesar | AAJ61646MC/E | |
| Storage phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen | |
| Storm 860 phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | – |
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