In-vitro- Methode zur Kontrolle Konzentrationen Halogenkohlenwasserstoffe in kultivierten alveolären Epithelzellen
Summary
Wir beschreiben eine einfache Protokoll speziell für die präzise und kontrollierte Konzentrationen von Sevofluran oder Isofluran in-vitro- zu erreichen, um unser Verständnis der Mechanismen der epithelialen Lungenversagen zu verbessern und Roman testen Therapien für akute Atemnotsyndrom.
Abstract
Akute Atemnotsyndrom (ARDS) ist ein Syndrom der diffuse alveoläre Schädigung mit eingeschränkter alveoläre Flüssigkeit Clearance und schwere Entzündungen. Die Verwendung von halogenierten Substanzen wie Sevofluran oder Isofluran, für die Sedierung von Patienten der Intensivstation (ICU) kann verbessern Gasaustausch, alveoläre Ödem reduzieren und dämpfen Entzündungen bei ARDS. Es fehlen jedoch Daten über die Nutzung der inhalierten Mittel zur kontinuierlichen Sedierung auf der Intensivstation zu Lungenschäden vorzubeugen oder zu behandeln. Um die Auswirkungen von halogenierten Agenten auf alveolären Epithelzellen “physiologischen” Bedingungen zu untersuchen, wir beschreiben ein einfaches System für Zellkulturen an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit und setzen sie an halogenierten Agenten bieten präzise kontrollierte “Luft” Brüche und “Medium” Konzentrationen für diese Mittel. Wir entwickelten eine versiegelte luftdichten Kammer in der Platten mit menschlichen alveoläre verewigt Epithelzellen einen präzisen, kontrollierten Bruchteil von Sevofluran oder Isofluran verwenden einen kontinuierlichen Gasstrom durch eine Narkose Maschine-Schaltung zur Verfügung gestellt ausgesetzt sein könnten. Zellen wurden 24 Stunden lang 4 % Sevofluran und Isofluran 1 % ausgesetzt. Gas-Massenspektrometrie wurde durchgeführt, um die Konzentration der halogenierten Wirkstoffe gelöst in das Medium zu bestimmen. Nach dem ersten waren Stunden, die Konzentrationen von Sevofluran und Isofluran mittelfristig 251 mg/L und 25 mg/L, bzw.. Die Kurven der Konzentrationen von Sevofluran und Isofluran aufgelöst in das Medium zeigten ähnliche Kurse im Laufe der Zeit mit einem Plateau erreicht eine Stunde nach der Exposition.
Dieses Protokoll wurde speziell entwickelt, um präzise und kontrollierte Konzentrationen von Sevofluran oder Isofluran in Vitro , unser Verständnis der Mechanismen, die in epithelialen Lungenschädigung bei ARDS zu verbessern und neue Therapien für test erreichen die -Syndrom.
Introduction
Akute Atemnotsyndrom (ARDS) ist ein klinisches Syndrom gekennzeichnet durch diffuse alveoläre Schädigung, Lungenödem und Linksventrikuläre respiratorische Insuffizienz. Obwohl ARDS mehr als 10 % der Intensivstation (ICU) Kinobesuche und fast 25 % der ICU-Patienten, die eine mechanische Lüftung darstellt, ist es noch ein unter anerkannten Herausforderung für Kliniker, mit einer Krankenhaus-Mortalität von 35-45 %1. Trotz intensiver Forschung ist die Identifizierung eines effektiven ARDS pharmakologische Therapie oder Prävention bisher fehlgeschlagen. Zwei wichtige Funktionen tragen zur Mortalität bei ARDS: alveoläre Flüssigkeit Clearance (AFC) (d. h. die veränderte Resorption der alveoläre Ödem Flüssigkeit aus Lufträume distal Lunge) und schwere Entzündungen2beeinträchtigt. Da ARDS Sterblichkeit hoch bleibt, gehört aktuellen Initiativen auch Primärprävention; Allerdings ist eine zentrale Herausforderung zur Identifizierung von Risikopatienten in denen ARDS voraussichtlich entwickeln wird und wer profitieren würde, wenn ARDS vereitelt werden konnten.
Flüchtigen halogenierten Anästhetika Sevofluran und Isofluran, sind weit verbreitet in Vollnarkose im OP-Saal zur Verfügung stellen. Weltweit mehr als 230 Millionen Patienten, die eine größere Operation jährlich erfordern allgemeine Anästhesie und Beatmung3, und klinische Ergebnisse und Gesundheitswesen Auslastung4 postoperative pulmonale Komplikationen beeinträchtigen . Die Verwendung von Sevofluran anstelle von Propofol wurde verbesserte Lungenentzündung bei Patienten mit Thoraxchirurgie und signifikante Abnahme der Nebenwirkungen wie ARDS und postoperativen pulmonalen Komplikationen5zugeordnet. In ähnlicher Weise hatte eine Vorbehandlung mit Isofluran schützende Wirkung auf die Atemwege Mechanik, Sauerstoffversorgung und Hämodynamik in experimentellen Tiermodellen von ARDS6,7. Obwohl weitere Studien die Auswirkungen von inhalativen Agenten auf die Ergebnisse im noncardiac Surgery gerechtfertigt sind, ist eine ähnliche Abnahme der pulmonalen Komplikationen in einer Meta-Analyse zeigt, dass inhaliert Anästhetika kürzlich beobachtet worden – als gegen eine intravenöse Anästhesie – sind signifikant assoziiert mit einem Rückgang der Sterblichkeit für Herzchirurgie8.
Prospektive Daten über den Einsatz von volatilen Agenten für die Sedierung von Intensivpatienten zur Vorbeugung oder Behandlung Lungenschäden fehlt. Jedoch mehrere Studien unterstützen die Wirksamkeit und Sicherheit von inhalativen Sevofluran jetzt für die Sedierung von Intensivpatienten und präklinische Studien haben gezeigt, dass inhalierte Sevofluran und Isofluran7,9 Gasaustausch verbessern, reduzieren alveoläre Ödem und abschwächen Entzündungen in experimentellen Modellen des ARDS. Darüber hinaus verringert Sevofluran Typ II Epithelzelle Schaden10, während Isofluran die Integrität der Alveolar-Kapillare Barriere durch Modulation der tight Junction Protein11unterhält. Allerdings sind weitere Studien notwendig, um zu überprüfen, inwieweit der experimentelle Nachweis der Orgel Schutz von inhalativen Sevofluran und Isofluran auf den Menschen übersetzt werden könnte. Eine erste Single-Center randomisierte kontrollierte-Studie (RCT) aus unserer Gruppe festgestellt, dass frühe Verwendung von inhalativen Sevofluran bei Patienten mit ARDS verbesserte Sauerstoffversorgung, verringerte Niveaus von einigen Pro-inflammatorische Marker und reduzierten Lunge epithelialen zugeordnet wurde Schaden Sie, wie die Ebenen der löslichen Form des Rezeptors für advanced Glycation Endprodukte (sRAGE) im Plasma und alveoläre Flüssigkeit12bewertet.
Zusammengenommen könnten die wohltuende Wirkung von Sevofluran und Isofluran auf Lungenschädigung verweisen auf mehrere biologischer Signalwege oder Funktionsabläufe, die abhängig von der Wut Weg sind nämlich alveoläre Flüssigkeit Clearance (AFC), epitheliale Schädigung, Translokation des nuclear Factor (NF)-κB, und Makrophagen Aktivierung. Darüber hinaus kann Sevofluran Ausdruck der Wut-Protein selbst beeinflussen. Da frühere Forschungen durch unser Research-Team und andere entscheidende Rollen für RAGE in alveoläre Entzündung und Lunge epithelialen Verletzungen/Reparatur bei ARDS unterstützt, entwarfen wir ein experimentelles Modell zum translational Verständnis der Mechanismen der Sevofluran in Lunge Schädigung und Reparatur13,14,15. Die in-vitro- Effekte von Sevofluran und Isofluran wurden in einer neuartigen menschlichen alveoläre epithelialen Primärzelle Linie speziell entwickelt, um die Luft-Blut-Schranke der peripheren Lunge, hAELVi (menschlichen alveoläre epithelialen LentiVirus Studie untersucht. verewigt), mit alveolären Typ-ähnliche Eigenschaften einschließlich funktioneller enge Kreuzungen16.
Während der Vorbereitung des Design unserer in-vitro- Untersuchungen (z. B. Kulturen der alveolären Epithelzellen an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit mit der Exposition gegenüber “inhaliert” Sevofluran oder Isofluran, verstanden wir aus bisher veröffentlichten Studien, die Bruchteile von Sevofluran sind nur in der “Luft” Schnittstelle17,18,19 mit standard-Monitore (ähnlich denen in einer klinischen Einstellung) untersucht worden. Halogenierte Agent-Konzentrationen wurden in der Regel nach die minimale alveoläre Konzentration (MAC)-Werte gewählt (z. B. beim Menschen, für Sevofluran, 0.5, 1,1 und 2,2 vol%, Vertreter, 0.25, 0.5 und 1 MAC; für Isoflurane, 0.6, 0.8, und 1.3 vol% repräsentieren jeweils 0,25, 0,5 und 1 MAC)20. Sevofluran und Isofluran-Konzentrationen wurden in der Tat nie in das Kulturmedium selbst, wodurch die Gültigkeit des früheren experimentelle Modelle/Instrumenten untersucht. Darüber hinaus verwendet die meisten Experimente eine anaerobe Glas, die versiegelt wurde, nachdem die Luft Mischung mit Sevofluran im Inneren gespült hatte. Da unser Ziel war es, alveoläre Epithelzellen “physiologischen” Bedingungen zu studieren, glaubten wir, dass ein anaerober Zustand möglicherweise nicht optimal und wäre nicht kompatibel mit lange experimentelle dauern. Daher wir unser eigenes System auf Zellkulturen an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit entwickelt und setzen sie auf halogenierte Agenten (Sevofluran und Isofluran) mit dem Ziel, präzise kontrollierte “Luft” Brüche und “mittlere” Konzentrationen für diese Mittel. Unserer Meinung nach ist dieser experimentellen Schritt, der bisher in der Literatur nicht beschrieben hat, vor jeder weiteren in-vitro- Untersuchungen von Sevofluran und Isofluran obligatorisch.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unser Protokoll beschreibt eine einfache Methode um Zellen auf einen genauen Bruchteil eines halogenierten Anästhetikum wie Sevofluran und Isofluran verfügbar zu machen. Darüber hinaus berichten wir hier – zum ersten Mal – eine strenge Korrelation zwischen der Gas-Anteil und die Konzentration von Sevofluran und Isofluran in das Kulturmedium selbst. Dieser grundlegende Schritt ermöglicht jetzt sicher unsere luftdichten Kammer nutzen, um die Auswirkungen dieser halogenierte Stoffe in einer kultivierten Monoschicht …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren erkennen Regionalrats Auvergne (“Programm Nouveau Chercheur De La Région Auvergne” 2013) und der französischen Agence Nationale De La Recherche und die Richtung Générale de L’Offre de Soins (“Programme de Recherche Translationnelle de Santé” ANR-13-PRTs-0010) für die Stipendien. Die Geldgeber hatten keinen Einfluss im Studiendesign, Durchführung und Analyse oder bei der Erstellung dieses Artikels.
Materials
| Sevoflurane | Baxter | Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged | |
| Isoflurane | Virbac | Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged | |
| Human Alveolar Epithelial cells | InScreenex | INS-CI-1015 | |
| huAEC Medium (ready-to-use) | InScreenex | INS-ME-1013-500ml | |
| Anesthetic machine circuit | Drager | Fabius | |
| Gas analyzer | Drageer | Vamos Plus | |
| Anesthetic gas filter | SedanaMedical | FlurAbsord | |
| Heated Humifier | Fisher&Paykel | MR850 | |
| Chamber | Curver | 00012-416-00 | |
| Gas chromatography coupled with mass detection | Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA | Trace 1310 with TSQ 8000evo | |
| Fused-silica column (30 m x 1.4 µm, 0.25 mm ID) | Restek, Lisses, France | Rxi-624Sil MS |
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