Непосредственный впрыск Интратекальное рекомбинантного адено связанные вирусов у взрослых мышей
Summary
Здесь мы представляем технику инъекций непосредственно Интратекальное, с использованием 1% лидокаина гидрохлорида в вирусного решение для обеспечения эффективного аденоассоциированный вирус доставки мелких животных и создать систему скоринга для прогнозирования эффективности трансдукции в Центральной нервной системы по степени переходных слабость, вызванных лидокаина.
Abstract
Интратекальное (ИТ) для инъекций аденоассоциированный вирус (AAV) привлекла большой интерес в ЦНС генной терапии в силу его безопасность, неивназивности и отличные трансдукции эффективность в ЦНС. Предыдущие исследования продемонстрировали терапевтического потенции AAV-доставлены генной терапии нейродегенеративных расстройств, его администрации. Однако были зарегистрированы высокие темпы непредсказуемым отказа из-за технического ограничения ИТ-администрирования в мелких животных. Здесь мы создали систему скоринга для обозначения степени успех поясничный прокол в мелких животных, добавив 1% лидокаина гидрохлорида в инъекционного раствора. Далее мы покажем, что степень переходных слабость после инъекции может предсказать эффективность трансдукции AAV. Таким образом этот метод впрыска ИТ может использоваться для оптимизации лечебные испытания в моделях мыши ЦНС заболеваний, которые поражают широким регионов центральной нервной системы.
Introduction
AAV может посредничать экспрессии генов долгосрочный и широко распространенных в ЦНС трансдукция с несколько побочных эффектов и таким образом стал одним из наиболее перспективных транспортных средств для генной терапии для лечения заболеваний ЦНС, включая боковой амиотрофический склероз (ALS), Хантингтон болезнь (HD), болезни Альцгеймера (AD), хранения лизосомных заболеваний (ЛСД), болезнь Гоше (GD) и нейрональных цероид lipofuscinosis (NCL)1. В настоящее время более чем 100 AAV серотипов были изолированы от людей и животных. Среди них, по крайней мере 12 были использованы в доклинических и клинических испытаний, в том числе наиболее часто используемые гена векторов, таких как AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 и rAAVrh.101,2,3,,4, 5,6.
Различные заболевания ЦНС требуют разных стратегий AAV доставки из-за различных пострадавших регионов ЦНС и типы клеток. CNS регионов и клеток типы, которые могут передают AAV варьируется в зависимости от серотип а также способ доставки. Например было показано rAAVrh10 передавать преимущественно астроциты при доставке системных внутривенном (IV), в то время как он преобразованы нейронов и глии при доставке Интратекальное инъекций4,7. Кроме того паренхима инъекций привели к местных трансдукции в близости от укола, тогда как в спинномозговой жидкости (CSF) через внутрижелудочкового или Интратекальное инъекции привело к широко распространенной ЦНС трансдукции8 . Исследования также продемонстрировали терапевтических потенции AAV-доставлены генной терапии нейродегенеративных расстройств, его администрации9,10,11. Заболеваний, которые влияют на широких областях ЦНС как ALS было показано Интратекальное инъекции в РСУ охватывают большинство областей, которые страдают от болезни с низкой дозы, по сравнению с системными доставки метод4,10. Недавние исследования также показали, что Люмбальная пункция может использоваться для вставки AAV в моделях мыши для ALS, что позволяет избежать возможных травм, связанных с Ламинэктомия и Интратекальное катетеризация4.
Экспериментальные прямые Люмбальная пункция был впервые использован для доставки агентов, особенно анестетики, спинного для анестезии и наркоза в 1885 году12,13. В настоящем докладе мы иллюстрируем Поясничная пункция это инъекционный метод у взрослых мышей с помощью 1% лидокаина гидрохлорид, местной анестезии Амид производные, в инъекционного раствора для оценки и контроля качества инъекций. Успешное инъекции были отмечены лидокаин индуцированной временный паралич, тогда как неудачных инъекций не показывать это поведение. Мы классифицировать уровень переходных слабость как один из пяти классов, чтобы помочь предсказать эффективность инъекции. Наконец мы покажем, что уровень трансдукции rAAVrh10 могут быть предсказаны класс паралич. Таким образом этот метод доставки AAV Интратекальное может использоваться для повышения AAV-опосредованной ген поставка для экспериментальной терапии заболеваний ЦНС.
Protocol
Representative Results
Discussion
Технически есть несколько критических шагов во время инъекции IT проснулись мышей. Во-первых, надлежащий контроль жест и фирма мышей на протяжении всей операции является необходимым условием для успешной доставки. Во-вторых самые сложные точки чувство межпозвонкового пространства с к?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась грант от ХЭБЭЙ провинций Департамент людских ресурсов и социального обеспечения (CY201605) и гранта от фонда естественных наук провинции Хэбэй (H2017206101), и мы очень благодарны доктора для ГАО Гуанпин, которые предоставили AAV для Это исследование.
Materials
| FVB/NJ mice | Charles River Laboratories China | ||
| Lidocaine hydrochloride monohydrate | HEOWNS | 73-78-9 | |
| AAV | Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School | ||
| 25µL Hamilton syringe/27-30g needle | GASTIGHT | 1702 | |
| O.C.T compond | SAKURA | 4583 | |
| H 2O 2 | SHUI HUAN PAI | 170401 | |
| Goat serum | Solarbio | S9070 | |
| Triton X-100 | LIFE SCIENCES | T8200 | |
| Rabbit anti-GFP | Life tech | G10362 | 1:333 dilution |
| The second antibody (goat-anti rabbit) | Jackson Immuno Research | 111-005-144 | 1:1000 dilution |
| VECTASTAIN ABC REAGENT | Vector Lab | PK-6100 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Lab | SK-4105 | |
| Mounting medium for fluorescence with DAPI | Vectorshield | H-1200 | |
| NaCl | Yong Da Chemical | ||
| NaH2PO4·2H2O | Yong Da Chemical | ||
| Na2HPO4·12H2O | Yong Da Chemical | ||
| Paraformaldehyde | Yong Da Chemical | 307699 | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 17083 | 25*75 mm |
| SUPER-SLIP MICRO-GLAS | Electro Microscopy Siences | 72236-60 | 24*60 mm |
| 15 ml Centrifuge tube | CORNING | 430790 | |
| 96 well cell culture cluster | Coster | 3599 | |
| 24 well cell culture cluster | Coster | 3524 | |
| 70% Ethanol | WEN ZHI | ||
| Gauze | Wei AN | 05171112 | 8cm*10cm*12cm |
| 1mL syringe | Hong Da | ||
| Microtubes | Plasmed | ||
| Micropipet | eppendorf | ||
| Peppet tips | Rainin | ||
| Centirifuge | eppendorf | 5427R | |
| Regerator | Haier | BCD-539WT | |
| Filter | MILLEX GP | R4PA42342 | |
| Pump | LongerPump | BT-100-2J/YZ1515X | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Freezing-microtome | Leica | CM1520 |
References
- Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76 (2014).
- Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. Viral vectors for gene delivery to the central nervous system. Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).
- Yang, B., et al. Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10. Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).
- Guo, Y., et al. A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).
- Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success–a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36 (2015).
- Federic, T., et al. Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs. Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).
- Ayers, J. I., et al. Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice. Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).
- Li, D., et al. Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS. 신경과학. 365, 192-205 (2017).
- Borel, F., et al. Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).
- Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).
- Wang, H., et al. Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).
- Wang, Y., et al. scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway. Brain Research. 1648, 1-10 (2016).
