Denne protokol giver de nødvendige skridt til at etablere og evaluere neonatal sepsis i 7 dage gamle mus.
Neonatal sepsis forbliver en global byrde. En prækliniske model til skærmen effektiv profylaktisk eller terapeutisk indgreb er nødvendigt. Neonatal mus polymicrobial sepsis kan være fremkaldt ved at indsprøjte cecal gylle intraperitoneal i dag af liv 7 mus og overvåge dem for den følgende uge. Præsenteres her er de detaljerede trin er nødvendige for gennemførelsen af denne neonatal sepsis model. Dette omfatter ligeledes, at en homogen cecal gylle bestand, fortynde det til en vægt – og kuld-justeret dosis, en oversigt over den overvågning tidsplan og en definition af observerede sundhed kategorier bruges til at definere slutpunkter, human. Generation af en homogen cecal gylle bestand fra poolede donorer tillader administration i mange kuld over tid, at reducere variation mellem donorer og forhindre brug af potentielt giftige glycerol. Overvågningsstrategien anvendes giver mulighed for foregribelse af overlevelse resultatet og identifikation af mus der ville senere gå videre til døden, giver mulighed for en tidligere identifikation af human slutpunktet. To vigtigste adfærdsmæssige funktioner bruges til at definere sundhed scorer, nemlig neonatal musene evne til at rette når de placeres på deres ryg og deres grad af mobilitet. Disse kriterier kunne potentielt anvendes til adresse Human slutpunkter i andre undersøgelser af neonatal sygdom i mus, så længe en pilotundersøgelse er udført for at bekræfte nøjagtigheden. Afslutningsvis giver denne tilgang en standardiseret metode til model nyfødte sepsis hos mus, men samtidig give ressourcer til at vurdere dyrevelfærd bruges til at definere begyndelsen Human slutpunkter for angrebne dyr.
Sepsis er en førende årsag til nyfødte smitsomme døde1. Fordi nyfødte sepsis er dårligt forstået, er der gjort lidt fremskridt i begge identifikation af udsatte nyfødte tidligt i sygdommen og udvikling af effektive behandlinger eller prophylaxes. Dette kræver anvendelsen af dyremodeller for sepsis til bedre at forstå de proces og test mulige interventioner. Derudover reagerer voksen gnavere forskelligt på sepsis, med statistisk signifikante forskelle i antallet af bakterier til at administrere for at få den samme dødelige dosis (LD) og forskelle i den resulterende host reaktion i forhold til nyfødte2. Neonatal sepsis har således, som skal undersøges i nyfødte. Flere voksne sepsis modeller har været brugt i sepsis forskning. Disse omfatter en intravenøs udfordring med specifikke organismer impliceret i voksne menneskers sepsis eller cecal ligatur og punktering (CLP). CLP er en endogen challange model hvor coecum kirurgisk er isoleret, forbundet og punkteret for at tillade lækage af tarmindhold i bughinden, i sidste ende fører til den systemiske formidling af mikrober og deres produkter3. Men den kirurgiske procedure skal udarbejde CLP er dødelig for nyfødte dyr; en alternativ metode er derfor nødvendigt at efterligne polymicrobial udfordringen af CLP til at fremkalde neonatal sepsis. Cecal gylle model for neonatal polymicrobial sepsis blev udviklet for at imødegå dette behov, hvorved cecal indholdet af dyr er høstet, suspenderet i sterile dextrose 5% i vand (D5W), og intraperitoneal indsprøjtes i nyfødte mus2. Dette er siden, blevet en stadig mere populær model til at studere sepsis hos nyfødte og voksne dyr og har betydeligt avancerede mekanistiske indblik i den sygdom proces4,5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15.
I betragtning af den stigende brug af denne model og ønske om forskere at direkte sammenligne resultater på tværs af publikationer, er der behov for de tekniske aspekter til at være godt beskrevet og standardiseret på tværs af undersøgelser. Standardisering gælder for tre aspekter af modellen, nemlig i) forberedelse af cecal gylle stock, ii) udarbejdelse af udfordring delprøver til injektion i de eksperimentelle dyr og iii) definitionen af det humane slutpunkt hvorved dyr anses nonsurvivors i udfordring eksperimenter. Specifikt, er metoder til at forberede cecal gylle bestanden ofte refereres til den oprindelige artikel at indføre model2. Et kort resumé af denne model er, at cecal indholdet fra voksne mus blev høstet, suspenderet i sterile D5W til en koncentration på 80 mg/mL og anvendes inden for 2 h til at injicere de forsøgsdyr. Denne originale model brugt mus i samme aldersgruppe, fra den samme leverandør placering, som var til huse i deres respektive forskningsfaciliteter for mindre end 2 uger før høst cecal indholdet. Brug af in-house opdrættet mus, øget selv om at reducere omkostningerne fra regelmæssige leverandør levering og giver mulighed for anvendelse af overskydende mus af en bredere vifte af køn og alder, også væsentligt donor-til-donor variabilitet. Dette motiveret udvikling af en alternativ teknik, hvorved cecal indhold fra flere mus blev samlet sammen til at forberede et stort lager, som derefter blev aliquoted og opbevares ved-80 ° C13. Denne alternative metode blev tilpasset af flere grupper14,15. Men denne tilpasning resulterede i nogle tekniske varianter, både i den opbevaring medier bruges (10% eller 15% glycerol eller D5W alene) og i strategien for filtrering til at fjerne partikler (flertrins filtrering gennem et 860 µm og derefter en 190 µm filter eller enkelte filtrations gennem 100 µm eller 70 µm filtre)13,14,15. Injektion af glycerol alene kan potentielt skade, at 25% – 50% glycerol indsprøjtninger har været brugt som en gnaver model af nyre skade16,17,18,19, 20. For at undgå utilsigtede bivirkninger af glycerol, cecal gylle stock forberedelse til mus i denne undersøgelse er frosset i D5W uden glycerol, og test af bakteriel levedygtighed fra opbevaring ved-80 ° C udføres. Den filtrering strategi, der anvendes i denne undersøgelse er en pass gennem en 70 µm filter, som ikke har været direkte sammenlignet med de andre filtrering strategier opført.
Dødelige vægt-justeret doser af injicerede cecal gylle kan variere fra anlæg til anlæg og skal titered ud til den ønskede dødelighed for enkelte grupper. Med forskellige udfordring doser ændre de ledsagende udfordring mængder af nødvendighed. Men denne metodologiske detalje er ikke blevet rapporteret før. Derudover strategier for standard procedurer, såsom intraperitoneal injektion, er sjældent udarbejdet på inden for litteraturen, men enkelte teknikker kan påvirke om nyfødte mus lække når injiceres og påvirke deres endelige resultater.
Dyrevelfærd, herunder en definition af human slutpunkt, er et centralt aspekt af denne model og i hvilken som helst model af infektion og betændelse i gnavere21. I 1998 offentliggjort den canadiske Rådet på Animal Care (CCAC) omfattende retningslinjer for human slutpunkt udvælgelse, definere den humane slutpunkt, som “nogen faktiske eller potentielle smerte, angst eller ubehag skal minimeres eller lindres ved at vælge den tidligste Endpoint er forenelige med de videnskabelige mål for forskningen”22. Andre også forsigtig at Human slutpunkter skal oprettes baseret på videnskabeligt grundlag og ikke på en subjektiv fortolkning af dyrets tilstand alene21. Mens der er et væld af ressourcer til klinisk, adfærdsmæssige, og huld tegn-baserede kriterier for human slutpunkt, selv i forbindelse med infektion og betændelse specielt21,23,24, ingen af disse , herunder CCAC retningslinjerne for human slutpunkt22, nævne nyfødte mus. Således er objektivt og videnskabeligt begrundede Human slutpunkter langt vanskeligere at etablere for nyfødte dyr, givet både deres begrænsede adfærdsterapi evner og manglende beviser fra kriterier som vægttab, der er almindeligt anvendt til voksen mus. I øjeblikket, kriterierne for human slutpunktet bruges til 5 til 12 dage gamle neonatal mus i cecal gylle litteratur alle referere tilbage til det originale manuskript, der indførte model2. I dette oprindelige papir, var definition af human slutpunkt for nyfødte dyr baseret på to kriterier; nemlig, placeringen af en mus uden for reden (spredning) og mangel på mælk steder havde været set at resultere i dødsfald inden for timer. Et komplicerende spørgsmål i tildele en human slutpunkt er at mælk steder blive svært at se i mus stammer med mørk pels, som den almindeligvis ansat C57BL/6J stamme, efter den første uge af livet, mens syge dyr er overvåget indtil den 14. dag i livet (DOL). Yderligere, døde dyr kan findes postchallenge ved anvendelsen af disse kriterier (egen observation, upubliceret); således, en strengere definition af human slutpunkt er nødvendige for at lindre lidelse til forsøgsdyr og undgå dødelighed i situationer hvor resultatet kunne præcist skimtes tidligere.
Alle tre metodologiske aspekter af cecal gylle model præsenteres i en standard operating procedure beskriver forberedelse af cecal gylle bestand, en metode til indsprøjtning forsøgsdyr der holder konstanten injektion volumen mellem doser og reducerer risikoen for lækager, og en definition af human slutpunkt for 7 til 12 dage gamle mus baseret på et system af adfærdsmæssige modellering. Adfærdsmæssige oplysninger af mus sundhed scorer fra over 240 forsøgsdyr blev indsamlet og grupperet efter sidste overlevelse resultatet, demonstrerer en tegn-drevet definition af human slutpunkt. Lidelser af forsøgsdyr er reduceret ved at identificere døende neonatal mus på det tidligst mulige tidspunkt, mens biologisk betydelig overlevelse resultater kan udledes ved at observere nøglevariabler. Den visuelle repræsentation af både cecal gylle forberedelse og neonatal mus adfærd vil tjene som en fremragende ressource til enhver gruppe studerer sepsis eller nyfødte udfordring model dyr.
Postnatal neonatal mus har meget begrænset mobilitet og undlader at rette sig efter at være placeret på deres ryg, selv når uantastet. Af DOL 7, alder af mus udfordret i denne model, en vifte af bevægelse spænder fra rettigheder-mobiltelefon til FTR-Mobile blev observeret i uantastet mus, med en væsentlig forskel, nemlig at en uantastet musen i denne alder ikke vise FTR-sløv adfærd. Kun mus udfordret med polymicrobial sepsis blev observeret for at blive FTR-sløv; denne reaktion kan derfor være en markør af sygdommens sværhedsgrad. Bliver opmærksomme på cutoff af en 90° vinkel fra vandret til hip bevægelse giver mulighed for den konsekvente og nøjagtige tildeling af sløv eller mobile hip bevægelse i mus. Tidsrammen på 4 s for at se, hvis en mus kan lige selv blev valgt fordi uantastet mus var i stand til konsekvent lige selv inden for denne tidsramme. Gentaget måling af samme mus blev undgået, mens tid til at rette og måling af hofte mobilitet var begrænset til 4 s, for at undgå alt for trættende med musen, som ellers kunne påvirke dens evne til at skaffe mad og varme og kunne påvirke dens Prognosen til at blive bedre. Oprettende sig fra både venstre og højre side blev observeret, og den højeste af scores, blev brugt til at bestemme, hvis musen var på en human slutpunkt, fordi nogle mus blev fundet til at vise FTR-Nonmobile på den ene side endnu har en højere mobilitet på den anden side og b e købedygtig genoprette til sidst.
Pointsystemet anvendes til at evaluere mus sundhed påberåbt sig anvendelsen af kategorisk cutoffs for hvad er et spektrum af bevægelse, og derfor kunne være tilbøjelige til individuelle bias. Sammen blev uddannet personale til at sikre, at hver person scorede mus det samme; dog vil der sandsynligvis være en grad af subjektivitet, hvilket fører til variation. Sammenhængen i scoring blev evalueret ved at have syv forskere, der ikke havde tidligere udført neonatal mus overvågning lære de krav, der er skitseret i denne protokol og video, derefter, uafhængigt tildele adfærd og bestemme Human slutpunkt. En 97% nøjagtighed blev observeret med scoring udføres på 60 udfordret mus, hvilket tyder på, at enkelte bias ikke spille en væsentlig rolle i de adfærdsmæssige tildelinger af denne model. Den præsenteres adfærdsmæssige kontrol protokol er baseret på observationer af dyr udfordret på DOL 7, men mus yngre end 6 dage i en uantastet sund tilstand konsekvent lige ikke selv. De beskrevne humane slutpunkt kriterier kunne således ikke anvendes direkte til yngre mus. Hvis yngre mus bruges i denne eksperimentelle model, eller hvis en anderledes udfordring model med forskellige sygdom kinetik anvendes, skal derefter egnet Human slutpunkt kriterier være udviklet og afprøvet for at undgå eutanasi af mus der ville ellers, i sidste ende, Genskab. Pointsystemet viser en robust metode til at forbedre Human slutpunkt klassificering, der med test og bekræftelse, potentielt kunne anvendes til andre modeller.
Hvert præparat af cecal gylle eller brug af en ny mus stamme kræves retitration af cecal gylle dosis til at administrere for at opnå en lignende dødelig dosis. Hvert præparat blev standardiseret af udlæsning af interesse, nemlig overlevelse, snarere end at give den samme bakterietallet. Hver cecal gylle forberedelse levedygtige bakteriel koncentration varieret lidt, potentielt skyldes forskelle i donorens commensal bakterier og afvigelser i vægten tilbage i cellen sien af cecal gylle stock postfiltration. Under titrering af cecal gylle, de to første kuld var opdelt i to grupper og hver halvdel af kuldet blev udfordret med en af de to doser, så at hver af doserne vil blive testet i to kuld. Hvis den resulterende overlevelsesraten ikke svarede til det krævede niveau, så udfordring dosis var enten steg eller faldt med 5% – 10% og forsøget gentages. Flere kuld blev brugt for at tage højde for kuld på kuld forskelle, der kunne forårsage modstand eller øget følsomhed over for sepsis på tværs af et kuld. Det var vigtigt at præcist titer cecal gylle bestanden med hver ny forberedelse at sikre, at den nye titrering af cecal gylle var sammenlignelige med tidligere cecal gylle præparater. Perioder af overskydende støj og vibrationer, specielt under komprimering af asfalt og opførelsen af en nærliggende bygning og vejen, blev observeret for at øge stress i dæmninger. Dette korreleret med større procentdel af cannibalization, og påvirket dødeligheden for overlevelse eksperimenter, selv påvirker uantastet mus, der angiver, at der kan være fremmed virkninger på neonatal overlevelse, som også skal kontrolleres.
Forudgående metoder for cecal gylle stock forberedelse opført brugen af friske cecal gylle eller forberedelse af frosne cecal gylle, ved hjælp af en række forskellige metoder, herunder opbevaring i glycerol, der ville uundgåeligt blive overført under udfordringen. Mens brugen af friske cecal gylle giver fordelen at have en bakteriel sammensætning tættest på oprindelige cecal indhold, er der risiko for afvigelsen mellem enkelte donor mus på grund af variationen af commensal bakterier. Mens dette blev minimeret ved hjælp af cecal donorer fra samme leverandør med minimal tid mellem ankomst og progression af eksperimentet, dette kunne blive en cost-uoverkommelige mulighed for nogle laboratorier og præsenteret en anden timing logistik udfordring i at have alder-matchede mus findes når indlede en cecal gylle eksperimentere i neonatal mus, der var 7 dage gammel. En alternativ metode til at bruge friske cecal gylle var udnyttet, hvor flere voksne donorernes cecal indholdet var samlet, genopslemmes i D5W, frosne ved-80 ° C uden glycerol, og optøet en alikvot på et tidspunkt til eksperimenter. Udnyttelse af voksen donor cecal gylle at studere neonatal sepsis kunne potentielt overføre arter af bakterier til stede i cecal gylle neonatal musen ikke har været udsat for, men det er en strategi, der giver mulighed for undersøgelse af sepsis i neonatal mus og har været brugt til at studere neonatal mus biologi i de sidste13,14,15. Cecal gylle blev fortyndet i D5W at give ernæring til bakterier, som tillod oprettelsen af en aktiv infektion, når bakterierne blev sprøjtet, og blev gjort for at efterligne tilgængelighed af næringsstoffer i bughulen under nekrotiserende enterocolitis. Glycerol blev ikke medtaget som en stabilisator i frysning bakterier på grund af de potentielle negative bivirkninger, der kunne opstå fra glycerol injektion alene. Hvis glycerol havde været inkluderet i cecal gylle forberedelse, så den potentielle skade at glycerol alene kunne fremkalde ville har brug for at blive testet ved at medtage en glycerol-only (mangler cecal gylle) injektion i mus, som ville have øget mus skik. Bakterier levedygtighed cecal gylle bestande blev testet efter frysning cecal gylle lager uden glycerol og fandtes for at være konstant, med ingen ændring i bakterier koncentration i separate delprøver af den samme cecal gylle forberedelse opbevares ved-80 ° C over en 6 månedersperiode. Dette tyder på, at opbevaring uden glycerol er muligt at yde en konsekvent biologiske resultatet. Brug af en bulk-forberedt frosne cecal gylle lager også tilladt til brug af mus avlet in-house, at reducere omkostningerne og udnytte mandlige mus, der ellers ville være overskydende fra avl, derfor mus spild.
Identifikation af mislykkede udfordringer i mus var vigtigt at undgå at tilføje ekstra støj til systemet. Efter at være undergivet en intraperitoneal injektion af cecal gylle, blev musene observeret for tilstedeværelsen af en bule under huden, som angivet en mislykket injektion, der var faktisk subkutane. Mus blev observeret for utætheder på injektionsstedet, både umiddelbart efter nålen fjernelse og tillader dem at tage et skridt efter injektionen, fordi mus ville undertiden (sjældent) lække kun efter flytning lemmer af injektionsstedet ved at tage et skridt. Tilstedeværelsen af en bule eller lækage efter injektionen resulterede i at fjerne musen fra analysen. Efter alt, kunne enten af disse resultere i et andet resultat på grund af forkert mængden af cecal gylle injiceres som en 5% forskel i udfordring dosis er blevet observeret for at påvirke efterfølgende overlevelse.
Cecal gylle udfordring eksperimenter ofte kræves varierende mål dødelige doser med varierende vægt-justeret doser. På grund af dette, kan injektionsvolumener variere fra så lidt som 20 µL og op til 100 µL. Den forholdsmæssige eksperimentelle fejl forbundet med døde nål ændrer lydstyrken også sammen med Injektionsvolumen, stigende sværhedsgrad for at direkte sammenligne forskellige doser. Med en simpel ændring af standardisere Injektionsvolumen, er denne kilde af variansen fjernes fra eksperimentet.
Neonatal musen adfærdsmæssige overvågningssystem anvendes i denne protokol er først af sin art. Forskere opsat på at udføre etiske forskning med nyfødte mus er ofte konfronteret med udfordrende manglen på ressourcer til at vurdere dyrets velbefindende i denne alder. Den præsenteres intuitiv og ensartet overvågningssystem begynder at tage denne videnskløft. Vigtigst, denne beviser-driven tilgang ikke kun øger kvaliteten af eksperimentelle data opnået men, på samme tid, reducerer også de eksperimentelle dyr lidelser.
The authors have nothing to disclose.
Særlig tak til Claire Harrison og Animal Care anlægget på British Columbia children’s Hospital Research Institute (BCCHR) for deres støtte i den animalske arbejde, samt at Dr. Po-Yan Cheng for deres vejledning og input på animalsk kontrol og velvære.
0.1 – 20 μL pipette tips | VWR | 732-0799 | |
1.8 mL Microcentrifuge tube | Costar | 3621 | |
100 – 1000 μL pipette tips | VWR | 732-0801 | |
1 – 200 μL pipette tips | VWR | 732-0800 | |
15 mL Centrifuge tube | FroggaBio | TB15-25 | |
23G1 needles | Becton Dickinson | 305145 | only the needle, not the syringe, used for pinning mouse to styrofoam |
28G 0.5 mL Insulin syringe | BD | 329461 | |
2 mL Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
50 mL Centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
5 mL pipette | Costar | 4487 | |
6 – 10 week old C57BL/6J adult mice | Jackson Laboratories | 664 | |
7 + day old C57BL/6J neonatal mice | Bred in house | n.a | |
70 μm Cell strainer | Falcon | 352350 | |
Defibrinated Sheep's Blood | Dalynn | HS30-500 | |
Dextrose 5% Water (D5W) | Baxter | JB0080 | |
Dissecting forceps | VWR | 82027-386 | |
Dissecting Scissors, Sharp Tip | VWR | 82027-592 | |
Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip | VWR | 82027-594 | |
Ethanol (HistoPrep 95% Denatured Ethyl Alcohol) | Fisherbrand | HC11001GL | diluted to 70% with double distilled water |
Ethanol-proof marker; Lab marker | VWR | 52877-310 | |
EZ Anesthesia Vaporizer | EZ Anesthesia | EZ-155 | |
Germinator 500, Dry sterilize surgicial instrument (Hot bead sterilizer) | Braintree Scientific | GER 5287-120V | |
Isoflurane | Fresenius Kabi | CP0406V2 | |
Micro Spatula | Chemglass | CG-1983-12 | |
Pipette-Aid | Drummond | 4-000-100 | |
Rainin Classic Pipette PR-1000 | Rainin | 17008653 | |
Rainin Classic Pipette PR-20 | Rainin | 17008650 | |
Rainin Classic Pipette PR-200 | Rainin | 17008652 | |
Scale | Sartorius | BL 150 S | |
Specimen forceps | VWR | 82027-440 / 82027-442 | |
Square 1000 mL Storage Bottle | Corning | 431433 | |
Styrofoam board | Any | n.a | |
Sure-Seal Mouse/Rat euthanasia chamber | Euthanex | EZ-178 | |
Tryptic Soy Agar | Sigma-Aldrich | 22091-2.5KG | |
VX-200 Lab Vortex Mixer | Labnet International | S0200 | |
weigh paper | Fisherbrand | 09-898-12B |