Denne protokollen gir de nødvendige trinnene for å etablere og evaluere neonatal sepsis i 7 dager gamle mus.
Neonatal sepsis forblir en globale byrden. En prekliniske modell til skjermen effektive forebyggende eller terapeutiske tiltak er nødvendig. Neonatal musen polymicrobial sepsis kan indusert ved injisere cecal slurry intraperitoneally i dag av livet 7 mus og overvåking for følgende uke. Presenteres her er de detaljerte trinnene nødvendig for gjennomføringen av denne neonatal sepsis modellen. Dette inkluderer å gjøre en homogen cecal slurry lager, fortynne den å en vekt – og søppel-justert dose, disposisjoner for overvåking plan, og en definisjon av observerte helse kategorier brukes til å definere Human endepunktene. Generering av en homogen cecal slurry lager fra gruppert givere gir administrasjonen i mange søppel over tid, reduserer variasjon mellom givere og hindrer bruk av potensielt giftig glyserol. Overvåking strategien som brukes tillater påvente av overlevelse utfallet og identifikasjon av musene som ville senere fremgang til døden, slik at en tidligere identifikasjon av Human sluttpunktet. To hovedfunksjoner for atferdsdata brukes til å definere helse score, nemlig evnen til neonatal mus å rette seg selv når den plasseres på ryggen og deres nivå av mobilitet. Disse kriteriene kan potensielt brukes til adressen Human endepunktene i andre studier av neonatal sykdom i mus, så lenge en pilotstudie er utført for å bekrefte nøyaktigheten. Avslutningsvis gir denne tilnærmingen en standardisert metode til modell nyfødte sepsis i mus, samtidig som ressurser for å vurdere dyrevelferd brukes til å definere tidlig Human endepunktene for utfordret dyr.
Sepsis er en ledende årsak til menneskelige Nyfødte smittsomme dødsfall1. Fordi nyfødte sepsis er dårlig forstått, har liten fremgang blitt gjort begge identifisere i risikosonen nyfødte tidlig under sykdom og utviklingen av effektive behandlinger eller prophylaxes. Dette nødvendiggjør bruk av dyr modeller av sepsis for bedre å forstå prosessen og test mulig intervensjon. Videre reagere voksen gnagere forskjellig på sepsis, med statistisk betydelige forskjeller i antall bakterier å administrere for å få samme dødelig dose (LD) og forskjellene i resulterende vert respons i forhold til nyfødte2. Således, neonatal sepsis har å bli studert i nyfødte. Flere voksne sepsis modeller har blitt brukt i sepsis forskning. Disse inkluderer en intravenøs utfordring med bestemte organismer innblandet i voksen menneskelige sepsis eller cecal hemorroider og punktering (CLP). CLP er en endogen utfordring modell der cecum er kirurgisk isolert samskrevet og punctured for å tillate lekkasje av intestinal innholdet i peritoneum, til slutt fører til systemisk formidling av mikrober og deres produkter3. Men er den kirurgiske prosedyren må etablere CLP dødelig for nyfødte dyrene; en alternativ metode er derfor nødvendig å etterligne polymicrobial utfordringen med CLP å indusere neonatal sepsis. Cecal slurry modell for neonatale polymicrobial sepsis ble utviklet for å møte dette behovet, der cecal innholdet av dyr høstet, suspendert i sterilt druesukker 5% i vannet (D5W) og intraperitoneally injisert i nyfødte mus2. Dette har siden blitt et stadig mer populært modell å studere sepsis i både nyfødte og voksen dyr og har betydelig avansert mekanistisk innsikt i sykdommen sin prosessen4,5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15.
Gitt den økende bruken av denne modellen og ønske forskere direkte sammenligne resultater over publikasjoner, er det behov for de tekniske aspektene være godt beskrevet og standardisert over studier. Standardisering gjelder tre aspekter av modellen, nemlig i) utarbeidelsen av cecal slurry aksjen, ii) utarbeidelsen av utfordringen dele for injeksjon i forsøksdyr, og iii) definisjonen av Human endepunktet der dyr anses nonsurvivors utfordring eksperimenter. Spesielt refereres metoder å forberede cecal slurry aksjen ofte til den opprinnelige artikkelen introduserer modell2. En kort oppsummering av denne modellen er at cecal innholdet fra voksen mus ble høstet, suspendert i sterilt D5W til en konsentrasjon av 80 mg/mL og brukes innen 2 t å injisere forsøksdyr. Denne opprinnelige modellen brukes mus på samme alder, fra samme leverandør sted, som var plassert i sine respektive forskningsanlegg for mindre enn 2 uker før høsting cecal innholdet. Bruk av interne avlet mus, økt selv om redusere kostnadene fra faste leverandøren levering og tillate bruk av overflødig mus til et bredere spekter av kjønn og alder også vesentlig giver-til-donor variasjon. Dette motivert utviklingen av en alternativ teknikk, der cecal innholdet fra flere mus ble samlet sammen for å forberede et stort lager, som var så aliquoted og lagrede-80 ° C13. Denne alternative metoden ble tilpasset av flere grupper14,15. Men at tilpasning resulterte i noen tekniske variasjoner, både i lagringsmediet brukes (10% eller 15% glyserol eller D5W alene) og i strategien for filtrering å fjerne partikler (flertrinns filtrering gjennom en 860 µm og, deretter en 190 µm filter eller enkelte filtrations gjennom 100 µm eller 70 µm filtre)13,14,15. Injeksjon av glyserol alene kan potensielt forårsake skade, gitt at 25% – 50% glyserol injeksjoner har vært brukt som en gnager modell av nyre skader16,17,18,19, 20. For å unngå uønskede bivirkninger av glyserol, cecal slurry lager forberedelse til mus i denne studien er frosset i D5W uten glyserol, og tester av bakteriell levedyktighet fra lagring ved-80 ° C utføres. Filtrering strategien som brukes i denne studien er en passere en 70 µm filter, som ikke har vært direkte forhold til andre filtrering strategier oppført.
Dødelige vekt-justert doser av injisert cecal slurry kan variere fra anlegg til anlegg og skal titered ut til ønsket lethality for individuelle grupper. Med annerledes utfordring doser endre tilhørende utfordring volumene av nødvendighet. Men er disse metodologiske detaljene ikke rapportert før. Videre strategier for standard prosedyrer, for eksempel intraperitoneal injeksjon, er sjelden utdypet i litteraturen, men individuelle teknikker kan påvirke om nyfødte mus lekke når injisert og påvirke deres endelige resultatene.
Dyrevelferd, inkludert en definisjon av Human sluttpunkt, er et sentralt aspekt av denne modellen, og i noen modell for infeksjon og betennelse i gnagere21. I 1998 publisert den kanadiske Council på dyr omsorg (CCAC) omfattende retningslinjer for valg av Human sluttpunktet definerer Human sluttpunktet som “aktuell eller potensiell smerte, ubehag, eller ubehag bør minimert eller lindres ved å velge de tidligste endepunktet som er kompatibel med vitenskapelige målene for forskningen”22. Andre også forsiktig at Human endepunktene må opprettes basert på vitenskapelig begrunnelse i stedet for en subjektiv tolkning av dyrets staten alene21. Mens det er et vell av ressurser for klinisk, atferdsdata, og kroppen-tilstand tegn-baserte kriterier for Human sluttpunktet, selv i sammenheng med infeksjon og betennelse spesielt21,23,24, ingen av disse , inkludert CCAC retningslinjene for Human endepunktet22, nevne nyfødte mus. Dermed er objektivt og vitenskapelig berettiget Human endepunktene mye vanskeligere å etablere for nyfødte dyr, gitt både deres begrenset atferdsmessige evner og mangel på bevis fra kriterier som vekttap, som er vanlig for voksen mus. Foreløpig kriteriene for Human sluttpunktet brukes for 5-12 dag-gamle neonatal mus i cecal slurry litteraturen alle henvisning tilbake til det opprinnelige manuskriptet som introduserte modell2. I denne originalt papir, var definisjonen av Human endepunkt for nyfødte dyr basert på to kriterier; nemlig, plasseringen av en mus utenfor reiret (spredning) og mangel på melk flekker hadde blitt sett resulterer i død innen timene. En kompliserende spørsmål i tilordne en human sluttpunktet er at melk flekker bli vanskelig å se i musen stammer med mørk pels, som ofte ansatt C57BL/6J belastningen, etter den første uken av livet, mens syke dyr overvåkes inntil 14 dag livet (DOL). Videre, døde dyr kan bli funnet postchallenge når du bruker disse kriteriene (eier observasjon, upublisert); Dermed er en strengere definisjon av Human sluttpunktet nødvendig for å lindre lidelse til forsøksdyr og unngå dødelighet i situasjoner der utfallet nøyaktig forholdet tidligere.
Alle tre metodologiske aspekter av cecal slurry modellen er presentert i en standard prosedyre detaljering utarbeidelsen av cecal slurry lager, en metode for å injisere forsøksdyr som holder injeksjon volum konstant mellom doser og reduserer faren for lekkasjer og en definisjon av Human endepunkt for 7 – 12 dag-gamle mus basert på et system atferdsmessige modellering. Atferdsdata informasjon musen helse score over 240 forsøksdyr var samlet og gruppert etter siste overlevelse utfallet, demonstrere en bevis-drevet definisjon av Human endepunkt. Lidelsene til forsøksdyr reduseres ved å identifisere døende neonatal mus på det tidligst mulig tidspunktet, mens biologisk betydelig overlevelse resultater kan utledes ved å observere viktige variabler. Den visuelle representasjonen av både cecal slurry forberedelse og neonatal mus atferd vil tjene som et utmerket ressurs til en gruppe studere sepsis eller nyfødte utfordring modell dyr.
Postnatal neonatal mus har svært begrenset mobilitet og ikke klarer å rette seg selv etter blir plassert på ryggen, selv når uimotsagt. Av DOL 7 år mus utfordret i denne modellen, en rekke bevegelse som spenner fra rettigheter-Mobile til FTR-Mobile ble observert i uimotsagt mus, med en viktig forskjell, nemlig at en ubestridt mus i denne alderen ikke vise FTR-apatisk atferd. Bare mus utfordret med polymicrobial sepsis ble observert for å bli FTR-apatisk; Dette svaret kan derfor være en markør av sykdommens alvorlighetsgrad. Å være oppmerksomme til cut-off av en 90-graders vinkel fra vannrett for hip bevegelse gir konsistent og presis tildelingen av sløv eller mobil hip bevegelse i mus. Tidsrammen 4 s se hvis musen kan rett selv ble valgt fordi uimotsagt mus kunne konsekvent rett seg innenfor denne tidsrammen. Gjentatt måling av samme musen ble unngått, mens tiden å rette seg selv og måling av hip mobilitet var begrenset til 4 s, for å unngå overdreven slitsomt musen, som ellers kunne berøre dens evne til å skaffe mat og varme og kan påvirke sin prognosen å bli bedre. Rettende seg fra både venstre og høyre side ble observert og høyere av poengsummer ble brukt til å fastslå om musen på en human endepunkt, fordi noen mus ble funnet for å vise FTR-Nonmobile på den ene siden men har en høyere mobilitet på den andre siden og b e gjenopprette til slutt.
Poengsystemet brukes til å evaluere musen helse avhengig av anvendelsen av kategoriske konsentrasjon til hva er et spekter av bevegelse, og derfor kan være utsatt for personlige bias. Personalet var trent sammen å sikre hver person scoret musene samme; imidlertid vil det sannsynligvis være et nivå av subjektivitet fører til variasjon. Konsistensen av scoring ble vurdert ved syv forskere som ikke hadde tidligere spilt neonatal musen overvåking lære kravene i denne protokollen og video, uavhengig tilordne atferd og bestemme Human endepunktet. En 97% nøyaktighet ble observert med scoring utføres på 60 utfordret mus, antyder at personlige bias ikke spille en betydelig rolle i atferdsdata tildelingene av denne modellen. Presentert atferdsmessige overvåking protokollen er basert på observasjoner av dyr utfordret på DOL 7, men mus yngre enn 6 dager i en ubestridt sunn tilstand konsekvent rette ikke seg selv. Dermed kan beskrevet Human endepunktet kriteriene ikke brukes direkte til yngre mus. Hvis yngre mus brukes i denne eksperimentell modell eller en annerledes utfordring modell med forskjellige sykdommen kinetics brukes, må deretter passende Human endepunktet kriterier være utviklet og testet for å unngå euthanasia mus som ville ellers, til slutt, gjenopprette. Scoring system viser en robust metode for å forbedre Human endepunktet klassifisering som, med testing og bekreftelse, kan potensielt brukes til andre modeller.
Hver utarbeidelse av cecal slurry eller bruk av en ny mus belastning kreves retitration av cecal slurry dosen administrere for å oppnå en lignende dødelig dose. Hvert preparat ble standardisert av avlesning av interesse, nemlig overlevelse, enn å gi den samme bakterielle tellingen. Hver cecal slurry forberedelse levedyktig bakteriell konsentrasjon varierte litt, potensielt skyldes forskjeller i donor gram-negative bakterier eller avvik i vekten igjen i cellen silen av cecal slurry lager postfiltration. Under Serine cecal gjødsel, de to første kull ble delt i to grupper og hver halvdel av søppel ble utfordret med en av to doser slik at hver av doser vil bli testet i to. Hvis den resulterende overlevelse ikke samsvarte ønsket nivå, deretter utfordring dosen var enten økt eller redusert med 5% – 10% og forsøket gjentas. Flere kull ble brukt hensyn til kull-til-kull forskjeller som kan føre til motstand eller økt mottakelighet for sepsis over en søppel. Det var viktig å nøyaktig titer cecal slurry aksjen med hver ny forberedelser for å sikre at nye Serine cecal slurry var sammenlignes med tidligere cecal slurry forberedelser. Overflødig støy og vibrasjon, spesielt under komprimering av asfalt og bygging av en bygning i nærheten og road, ble observert for å øke stress i demninger. Dette korrelert med økt forekomst av cannibalization og påvirket dødeligheten blant den overlevelse eksperimenter, selv påvirker uimotsagt mus, som angir at det kan være unødvendige virkninger på neonatal overlevelse som også må kontrolleres for.
Tidligere metoder for cecal slurry lager forberedelse inkludert bruk av fersk cecal slurry eller utarbeidelse av frosne cecal slurry, bruker en rekke metoder, inkludert lagring i glyserol som vil uunngåelig bli overført under utfordringen. Mens bruken av fersk cecal slurry inneholder også fordelen av en bakteriell komposisjon nærmest opprinnelige cecal innholdet, er risikoen av avvik mellom individuelle donor mus på grunn av variasjoner av gram-negative bakterier. Mens dette var minimert ved hjelp cecal givere fra samme leverandør med minimal tid mellom ankomst og progresjon av eksperimentet, dette kan bli en pris prohibitive alternativ for noen laboratorier og presentert en timing logistikk utfordring i å ha alder-matchet mus tilgjengelig når begynner en cecal slurry eksperimenter i neonatal mus som var 7 dager gamle. En alternativ metode å bruke fersk cecal slurry ble benyttet, der flere voksne donorer cecal innholdet var samlet, resuspended i D5W, fryses på-80 ° C uten glyserol, og tint én aliquot om gangen for eksperimenter. Utnyttelsen av voksen donor cecal slurry å studere neonatal sepsis kan potensielt overføre arter av bakterier i cecal gjødsel som neonatal musen ikke har vært utsatt for, men det er en strategi som muliggjør studiet av sepsis i neonatal mus og har blitt brukt til å studere neonatal musen biologi i siste13,14,15. Cecal slurry var fortynnet i D5W å gi næring til bakterier, som tillot etableringen av en aktiv infeksjon når bakterier ble injisert, og ble gjort for å etterligne tilgjengeligheten av næringsstoffer i bukhulen under necrotizing enterokolitt. Glyserol ble ikke inkludert som en stabiliserende agent i iskaldt bakterier på grunn av den potensielle negative bivirkninger som kan oppstå fra glyserol injeksjon alene. Hvis glyserol hadde vært med i cecal slurry utarbeidelse, deretter den potensielle skaden at glyserol alene kan indusere ville nød å bli testet for ved å inkludere en bare glyserol (mangler cecal slurry) injeksjon i mus, som ville ha økt mus bruk. Bakterier levedyktigheten til cecal slurry aksjer ble testet etter frysing cecal slurry lager uten glyserol og ble funnet for å være konstant, med ingen endring i bakterier konsentrasjon i separate dele den samme cecal slurry forberedelser lagret på-80 ° C over en 6 måneders periode. Dette antyder at lagringen uten glyserol er mulig å gi en konsistent biologiske utfall. Bruk av en bulk forberedt frosset cecal slurry lager også tillatt for bruk av mus avlet internt, redusere kostnader og utnytte mannlig musene som ellers ville være overflødig fra oppdrett, derfor redusere musen svinn.
Identifikasjon av mislykkede utfordringer i mus var viktig å unngå å legge ekstra støy til systemet. Etter å ha gjennomgått en intraperitoneal injeksjon av cecal slurry, ble musene observert etter en kul under huden, som indikeres en mislykket injeksjon som var faktisk subkutan. Mus ble observert lekkasjer på injeksjonsstedet, både umiddelbart etter nålen fjerning og etter tillater dem å ta et skritt etter injeksjon, fordi mus ville noen ganger (sjelden) lekkasje etter flytting ben i injeksjonsstedet ved å ta et skritt. Tilstedeværelsen av en kul eller lekkasje etter injeksjon resulterte i fjerne musen fra analysen. Tross alt, kan noen av disse resultere i et annet resultat på grunn av feil mengden cecal slurry injisert som en 5% forskjell i utfordringen dose har blitt observert for å påvirke påfølgende overlevelse.
Cecal slurry utfordring eksperimenter ofte krever ulike mål dødelige doser med varierende vekt-justert doser. Grunnet dette, kan injeksjon volumer variere fra så lite som 20 µL og opp til 100 µL. Forholdsmessig eksperimentelle feil forbundet med døde nål volumet endres også sammen med injeksjon volumet, økende vanskelighetsgrad å direkte sammenligne forskjellige doser. Med enkel endring av standardisere injeksjon volumet, fjernes denne kilden avvik fra eksperimentet.
Neonatal musen er atferdsdata overvåkingssystem brukes i denne protokollen er først i sitt slag. Forskere hensikt å drive etisk forskning med nyfødte mus er ofte møtt med utfordrende mangelen på ressurser å vurdere dyrets velvære i denne alderen. Presentert intuitivt og enhetlig overvåking systemet begynner å ta denne kunnskapen hullet. Viktigere, denne bevis-drevet ikke bare øker kvaliteten på eksperimentelle data innhentet men på samme tid, reduserer også lidelsene til forsøksdyr.
The authors have nothing to disclose.
Spesiell takk til Claire Harrison og dyr omsorg anlegget på British Columbia Children’s Hospital Research Institute (BCCHR) for deres støtte i dyr arbeidet, samt til Dr. Po-Yan Cheng for deres veiledning og innspill til dyr overvåking og velvære.
0.1 – 20 μL pipette tips | VWR | 732-0799 | |
1.8 mL Microcentrifuge tube | Costar | 3621 | |
100 – 1000 μL pipette tips | VWR | 732-0801 | |
1 – 200 μL pipette tips | VWR | 732-0800 | |
15 mL Centrifuge tube | FroggaBio | TB15-25 | |
23G1 needles | Becton Dickinson | 305145 | only the needle, not the syringe, used for pinning mouse to styrofoam |
28G 0.5 mL Insulin syringe | BD | 329461 | |
2 mL Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
50 mL Centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
5 mL pipette | Costar | 4487 | |
6 – 10 week old C57BL/6J adult mice | Jackson Laboratories | 664 | |
7 + day old C57BL/6J neonatal mice | Bred in house | n.a | |
70 μm Cell strainer | Falcon | 352350 | |
Defibrinated Sheep's Blood | Dalynn | HS30-500 | |
Dextrose 5% Water (D5W) | Baxter | JB0080 | |
Dissecting forceps | VWR | 82027-386 | |
Dissecting Scissors, Sharp Tip | VWR | 82027-592 | |
Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip | VWR | 82027-594 | |
Ethanol (HistoPrep 95% Denatured Ethyl Alcohol) | Fisherbrand | HC11001GL | diluted to 70% with double distilled water |
Ethanol-proof marker; Lab marker | VWR | 52877-310 | |
EZ Anesthesia Vaporizer | EZ Anesthesia | EZ-155 | |
Germinator 500, Dry sterilize surgicial instrument (Hot bead sterilizer) | Braintree Scientific | GER 5287-120V | |
Isoflurane | Fresenius Kabi | CP0406V2 | |
Micro Spatula | Chemglass | CG-1983-12 | |
Pipette-Aid | Drummond | 4-000-100 | |
Rainin Classic Pipette PR-1000 | Rainin | 17008653 | |
Rainin Classic Pipette PR-20 | Rainin | 17008650 | |
Rainin Classic Pipette PR-200 | Rainin | 17008652 | |
Scale | Sartorius | BL 150 S | |
Specimen forceps | VWR | 82027-440 / 82027-442 | |
Square 1000 mL Storage Bottle | Corning | 431433 | |
Styrofoam board | Any | n.a | |
Sure-Seal Mouse/Rat euthanasia chamber | Euthanex | EZ-178 | |
Tryptic Soy Agar | Sigma-Aldrich | 22091-2.5KG | |
VX-200 Lab Vortex Mixer | Labnet International | S0200 | |
weigh paper | Fisherbrand | 09-898-12B |