JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

Yakalama ve tıklama Kimya destekli RNA-interactome kullanarak RNA bağlanıcı proteinler tanımlaması (CARIC) strateji yakalama

Published: October 19, 2018
doi:
10.3791/58580
, , ,
1College of Chemistry and Molecular Engineering,Peking University, 2Beijing National Laboratory for Molecular Sciences,Peking University, 3Peking-Tsinghua Center for Life Sciences,Peking University, 4Synthetic and Functional Biomolecules Center,Peking University, 5Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education,Peking University

Summary

Her iki kodlama ve kodlamayan bağlayıcı proteinler tanımlamak için tıklatın Kimya destekli RNA-interactome yakalama (CARIC) strateji uygulamak için detaylı bir protokol RNA’ların sunulur.

Abstract

RNA bağlanıcı proteinler (RBPs) kapsamlı bir tanımlaması hücrelerdeki posttranscriptional düzenleyici ağ anlama anahtarıdır. RBP yakalama için yaygın olarak kullanılan bir strateji non-poly(A) RNA’ların çoğu proteinler tanımlanamayan bırakarak ökaryotik olgun mRNA üzerinde çoğunlukla oluşan Poliadenilasyon [Poli(a)] hedef RNA’ların, patlatır. Burada bir son zamanlarda bildirilen yönteminin metabolik etiketlerine göre birleştirerek poli(a) ve non-poly(A) RBPs transcriptome çapında yakalama sağlayan tıklama Kimya destekli RNA-interactome yakalama (CARIC) olarak adlandırdığı ayrıntılı yordamlar açıklar RNA’ların, in vivo UV cross-linking ve bioorthogonal etiketleme.

Introduction

İnsan genomu çeşitli mRNA’ların, rRNA’lar, tRNA da dahil olmak üzere kodlama ve kodlamayan RNA’ların (ncRNA’lar), küçük nükleer RNA’ların (snRNA), küçük genelde RNA’ların (snoRNAs) ve uzun kodlamayan RNA’ların (lncRNAs)1sentezlenir. Bu RNA’ların çoğunu RBPs giyim sahip ve Ribonükleoprotein parçacıklar (RNPs)2olarak işlev. Bu nedenle, RBPs kapsamlı bir tanımlaması çeşitli insan hastalıkları3,4,5‘ te karıştığı düzenleyici ağ arasında RNA’ların ve RBPs, anlamak için bir önkoşuldur.

Son birkaç yıldır insan7,8,9,10,11de dahil olmak üzere çeşitli ökaryotik sistemleri2,6‘ da keşfedilen RBPs büyük bir destek tanık olduk, fare12,13,14, Maya9,15,16, zebra balığı17, Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,21,22ve insan parazitleri23,24,25 . Bu gelişmeler tarafından Castello vd tarafından geliştirilen bir RBP yakalama stratejisi kolaylaştırdı 7 ve Baltz vd. vivo UV RNA ve onun etkileşen proteinler, poli(a) RNA’ların oligo(dT) yakalanması ve kütle spektrometresi (MS) cross-linking birleştiren 8 2012 yılında,-proteomik profil oluşturma dayalı. Ancak, bu poli(a) çoğunlukla sadece ~ %3 – %526ökaryotik transcriptome hesaba, olgun mRNA üzerinde bulunmaktadır gerçeği göz önüne alındığında bu yaygın olarak kullanılan strateji non-poly(A) RNA’ların çoğu ncRNA’lar de dahil olmak üzere, ile etkileşim RBPs esir alma yeteneğine sahip değildir ve pre-mRNA’ların.

Burada, son zamanlarda geliştirilen strateji poli(a) ve non-poly(A) RBPs27transcriptome çapında yakalanması için ayrıntılı yordamlar raporu. CARIC olarak adlandırılan, bu strateji vivo içinde UV cross-linking ve metabolik RNA’lar (tıklayın tepki olarak katılabilir bir bioorthogonal fonksiyonel grup içeren) photoactivatable ve “tıklanabilir” nükleozit analogları ile etiketleme birleştiren 4 – thiouridine (4SU) ve 5-ethynyluridine (AB). CARIC stratejisi ile ideal sonuçlar elde etmek için anahtar olan verimli metabolik etiketleme, UV cross-linking ve tıklayın tepki ve RNA bütünlük bakımından adımlardır. Tıklayın tepki katalizör olarak kullanılan Cu(I) RNA’ların parçalanma neden olabileceğinden, RNA parçalanma azaltabilir bir Cu(I) ligand esastır. Biz verimli tıklayın reaksiyonlar şiddetli RNA bozunması neden olmadan cep lysates gerçekleştirmek açıklar.

RBP yakalamak ve kimlik HeLa hücreleri içinde sadece bu protokol için açıklanan, ancak çeşitli hücre tiplerinin ve muhtemelen canlı organizmalar CARIC strateji uygulanabilir. RBP yakalama yanı sıra, bu protokolü de MS numune hazırlama ve protein tanımlama ve o kim proteomik deneyler ile aşina olmayan için yararlı olabilir miktar için aerodinamik adım adım yordamlar sağlar.

Protocol

Dikkat: uygulanabilir olduğunda kullanılan reaktifler RNase free şeklinde satın alınan veya çözünmüş RNase-serbest, çözücüler (çoğu durumda dietil pyrocarbonate (DEPC) için-tedavi su). RNA örnekleri ve Kimyasalları RNase free ele alırken, her zaman eldiven ve maske ve sık sık RNase kirlenmesini önlemek için onları değiştirmek. 1. hazırlanması, Lysate metabolik olarak etiketli ve UV çapraz bağlı hücre AB ve 4SU metabolik birleşme <o…

Representative Results

Kalite kontrol adımları temsilcisi sonuçları sunulmuştur. Sonuçlar 2.3.2 (Şekil 1). adımda anlatılan jel floresan analizi, 4.1.3 (Şekil 2A). adımda anlatılan western blot Analizi ve gümüş boyama analiz 4.2.2 (Şekil 2B) adımda açıklanan rakamlar içerir. Kalite kontrol adımları CARIC protokolleri optimizasyonu için kritik öneme sahiptir. Her zaman büyük ölçekli RBP tanımlam…

Discussion

Adil RNA bütünlük bakımından başarılı CARIC deneyler anahtarlarına biridir. Kısmi düşme gözlendi rağmen ile uygun ligandlar Cu(I) ve dikkatli kullanım özellikleri ile RNA bozulması önemli ölçüde, azalır. AB ve deneysel örneklerinde 4SU değiştirme oranları ve % 1,18 %0,46, sırasıyla vardır (veri gösterilmez). 2.000 uzunluğu ile bozulmamış RNA’ların için nt, RNA’ların ~ %90 içeren en az bir AB ve bir 4SU. 1.000 uzunluğu ile kısmen bozulmuş RNA’ların için nt, RNA’ların ~ %70 içere…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser Ulusal Doğal Bilim Vakfı, Çin hibe 91753206, 21425204 ve 21521003 ve ulusal anahtar araştırma ve geliştirme projesi 2016YFA0501500 tarafından desteklenmektedir.

Materials

HeLa ATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific 11995065
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo Fisher Scientific 10099141
Penicillin & Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
EU (5-ethynyl uridine) Wuhu Huaren Co. CAS:69075-42-9
4SU (4-thiouridine) Sigma Aldrich T4509
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific AM9625
UV cross-linker UVP CL-1000 Equiped with 365-nm UV lamp
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Sigma Aldrich D5758 To treat water. Highly toxic!
Tris·HCl, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15567027
LiCl Sigma Aldrich 62476
Nonidet P-40 Biodee 74385
EDTA-free protease inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 88265 One tablet for 50 mL lysis buffer.
LDS (Lithium dodecyl sulfate) Sigma Aldrich L9781
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC901024
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC501096
Streptavidin magnetic beads Thermo Fisher Scientific 88816
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 41639
Azide-biotin Click Chemistry Tools AZ104
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] Sigma Aldrich 762342
Sodium ascorbate Sigma Aldrich 11140
Azide-Cy5 Click Chemistry Tools AZ118
LDS sample buffer (4×) Thermo Fisher Scientific NP0008
10% bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0301BOX
EDTA Thermo Fisher Scientific AM9260G
RNase A Sigma Aldrich R6513
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Thermo Fisher Scientific 15525017
NaCl Sigma Aldrich S3014
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] J&K 315442
Triethanolamine Sigma Aldrich V900257
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20353
Urea Sigma Aldrich U5378
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma Aldrich 61743
Biotin Sigma Aldrich B4501
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich 30970
MaxQuant Version: 1.5.5.1
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  2. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
  3. Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. RNA-binding proteins in Mendelian disease. Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).
  4. Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive. Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).
  5. Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. Identifying proteins that bind to specific RNAs – focus on simple repeat expansion diseases. Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).
  6. Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).
  7. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  8. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  9. Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).
  10. Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).
  11. Castello, A., et al. Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells. Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
  12. Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).
  13. Liepelt, A., et al. Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).
  14. Liao, Y., et al. The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease. Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).
  15. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).
  16. Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).
  17. Despic, V., et al. Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition. Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).
  18. Wessels, H. H., et al. The mRNA-bound proteome of the early fly embryo. Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).
  19. Sysoev, V. O., et al. Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila. Nature Communications. 7, 12128 (2016).
  20. Reichel, M., et al. In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings. Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).
  21. Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).
  22. Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12, 42-53 (2016).
  23. Bunnik, E. M., et al. The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 17, 147-164 (2016).
  24. Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome. Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).
  25. Nandan, D., et al. Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture. PLoS ONE. 12 (1), e0170068 (2017).
  26. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
  27. Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).
  28. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  29. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
  30. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  31. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  32. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
  33. Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics. ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).
  34. Curanovic, D., et al. Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap. Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).
  35. Zheng, Y. X., Beal, P. A. Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).
  36. Nainar, S., et al. Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA. ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).
  37. Bao, X., et al. Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).
  38. Holmqvist, E., Vogel, J. RNA-binding proteins in bacteria. Nature Reviews Microbiology. , (2018).

Tags

Keywords: RNA-binding ProteinsCARICClick ChemistryRNA-interactome CapturePost-transcriptional Gene RegulationMRNANon-coding RNAHeLa CellsEU4SUUV Cross-linkingCell LysisRNA-protein Interaction
check_url/kr/58580?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image