Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

Summary

פרוטוקול זה מתאר פלורסצנטיות תנודות מבוסס-ספקטרוסקופיה בגישה לחקור אינטראקציות בין חלבונים מתווכים תא-תא אינטראקציות, כלומר חלבונים מותאם צמתי תא, ישירות בתאים חיים. אנו מספקים הנחיות מפורט על מכשיר כיול, חדרי קירור והקפאה, ניתוח, כולל תיקונים למקורות אפשריים החפץ.

Abstract

מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים כרוך תא-תא אינטראקציות, מתווך בדרך כלל על ידי חלבונים המקיימים אינטראקציה בין תאים שכנים. עניין, רק כמה מבחני מסוגלים במיוחד חיטוט כזה אינטראקציות ישירות בתאים חיים. כאן, אנו מציגים assay כדי למדוד את הכריכה של חלבונים באה לידי ביטוי על פני השטח של התאים הסמוכים, תא-תא באנשי קשר. Assay זו מורכבת משני שלבים: ערבוב של תאים המבטאים את החלבונים עניין התמזגו חלבונים שונה פלורסנט, ואחריו קרינה פלואורסצנטית תנודות ספקטרוסקופיה מדידות-תא-תא אנשי קשר באמצעות לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ סורק. נדגים את הכדאיות של זה וזמינותו בהקשר רלוונטי מבחינה ביולוגית על ידי מודד את האינטראקציה של החלבון קודמן דמוי עמילואיד 1 (APLP1) על פני תאים תאים צמתי. אנו מספקים פרוטוקולים מפורט על רכישת נתונים באמצעות טכניקות מבוססות קרינה פלואורסצנטית (סריקה קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה, קרוס-קורלציה למספר וניתוח בהירות) את הכיול כלי הנדרש. יתר על כן, נדון שלבים קריטיים ניתוח הנתונים וכיצד לזהות ולפתור וריאציות אות חיצוני, כדין, כגון אלה עקב photobleaching או תא תנועה.

באופן כללי, וזמינותו הציג ישימה לכל הומו – או אינטראקציית חלבון heterotypic תא-תא באנשי קשר, בין תאים סוגים זהים או שונים, יכול להיות מיושם על לייזר קונפוקלי מסחרי מיקרוסקופ סורק. דרישה חשובה היא היציבות של המערכת, אשר צריך להיות מספיק לחקור דינמיקה דיפוזיה של החלבונים עניין במשך מספר דקות.

Introduction

תהליכים ביולוגיים רבים להתרחש בכל האתרים של תא-תא אינטראקציות, למשל, תא-תא אדהזיה^1,2,3, תא-cell fusion⁴ וזיהוי הסלולר⁵. אירועים כאלה חשובים במיוחד במהלך הפיתוח של אורגניזמים רב תאיים, תקשורת, למשל, במהלך תגובות מערכת החיסון. תהליכים אלה הם בדרך כלל בתיווך חלבונים אשר מותאמים על פני השטח, קרי, ב קרום פלזמה (PM) של תאים שכנים ומבצעת אינטראקציות ספציפיות-הקשר תא-תא כי הם בדיוק הזמן והמרחב מוסדר. במקרים רבים, אינטראקציות אלה ישירה הומו – או אינטראקציות חלבון heterotypic טרנס , אך עשוי גם לכלול יונים או ליגנדים מתנהג כמו linkers חוץ-תאי¹. למרות חשיבות היסוד, יש מחסור של מבחני הבדיקה אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפי אלה ישירות בסביבה הטבעית של תאים חיים. שיטות רבות דורשות גם לשבירת תאים (למשל, הביוכימי מבחני כגון co-immunoprecipitation⁶), קיבעון (למשל, כמה טכניקות במיקרוסקופ אופטי סופר רזולוציה ו מיקרוסקופ אלקטרונים של תא-תא קשר⁷), או שאינם ספציפיים, כגון: צבירת / מבחני אדהזיה^8,9. כדי להתגבר על בעיה זו, טכניקות קרינה פלואורסצנטית יושמו מבוסס על קרינה פלואורסצנטית תהודה אנרגיה העברה (סריג)¹⁰ או קרינה פלואורסצנטית קומפלמנטציה¹¹. עם זאת, כדי להשיג מספיק קטן המרחקים בין fluorophores, שיטות אלה דורשים תוויות פלורסנט בצד חוץ-תאי של חלבונים¹⁰, פוטנציאל מתנגש עם טרנס אינטראקציות.

כאן, אנו מציגים חלופי המבוסס על ידי קרינה פלואורסצנטית assay עבור אינטראקציות חלבון-חלבון תא-תא באנשי קשר. גישה זו משלבת גישות קרוס-המתאם קרינה פלואורסצנטית (סריקה קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה (sFCCS), מספר קרוס-המתאם ואת הבהירות (ccN & B)), ערבוב של תאים המבטאים בונה פיוז’ן של החלבון של . עניין, למשל, קולטן אדהזיה. קולטני ובדוקים בתאים שמעצבת שני מסומנות עם שני חלבונים פלורסנט spectrally מופרדים (FPs), מתאיים הצד (ראה איור 1 א’).

השיטות מועסקים מבוססים על ניתוח סטטיסטי של תנודות פלורסצנטיות המושרה על ידי התנועה דיפוזיה של פיוז’ן פלורסנט חלבונים דרך נפח מוקד של לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ סורק. יותר בפירוט, וזמינותו רגשים פעפוע שיתוף של החלבונים עניין במחזור שני שכנים תא-תא באנשי קשר. אם החלבונים עוברים אינטראקציות טרנס , אלה מתחמי טרנס ויישא חלבונים פלורוסנט פולטות בשני ערוצים ספקטרלי, גורם תנודות פלורסצנטיות מתואם של שנינו פולטים. מצד שני, אם הכריכה לא מתרחשת, מספר תנודות של חלבונים מול PMs תהיה עצמאית, גורם תנודות לא מתואם. הרכישה יכול להתבצע בשתי דרכים: 1) sFCCS מבוסס על סריקה בצורת קו לאורך הקשר תא-תא, רגשים ביעילות את האינטראקציות במקום הממוקמים באזור הקשר. דרך ניתוח הטמפורלי של תנודות פלורסצנטיות, sFCCS מספקת גם מידע dynamics, קרי, מקדמי דיפוזיה של מתחמי חלבון; 2) ccN & B מבוססת על ניתוח pixel-wise של רצף של תמונות רכשה את האזורים קשר תא-תא. יש יכולת בדיקה של אינטראקציות מפה לאורך כל קשר עם איזור (ב מישור מוקד אחד), אך אינו מספק מידע על דינמיקה. שתי השיטות יכול להיות משולב עם ניתוח של הבהירות מולקולרית, קרי, האות הממוצע פלורסצנטיות הנפלטת ביחידת זמן אחת מתחמי חלבון באמצעי ולספק, לפיכך, הערכות של סטויכיומטריה של מתחמי חלבון- תא-תא אנשי קשר.

במאמר זה, אנו מספקים נתונים היסטוריים פרוטוקולים עבור הכנת הדוגמא, כיול המכשיר, רכישת נתונים וניתוח לבצע את הבדיקה הציג על לייזר קונפוקלי מסחרי מיקרוסקופ סורק. ניתן לבצע את הניסויים על כל כלי מצויד פוטון לספור או גלאי אנלוגי ולא אובייקטיבית עם מפתח נומרי גבוהה. אנו עוד יותר לדבר על שלבים קריטיים של הפרוטוקול, לספק ערכות תיקון עבור מספר תהליכי גורם תנודות אות artefactual, למשל, גלאי רעש, תנועה photobleaching או תא. פותח במקור כדי לחקור את האינטראקציות בין תאים חסיד, וזמינותו עשוי להיות שונה עבור השעיה תאים, או הותאם מודל ממברנה מערכות, למשל, unilamellar ענק שלפוחית (כשמרוגזים) או פלזמה ענקית קרום שלפוחית (GPMVs), המאפשר כימות של אינטראקציות בסביבות השומנים שונה או בהיעדר שלד התא מאורגן^12,13.

סריקת קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה גירסה שונה של קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה¹⁴ , תוכננה במיוחד כדי לחקור דינמיקה דיפוזיה איטית השומנים ממברנות¹⁵. הוא מבוסס על רכישה סריקה קו בניצב רה מ המכיל את החלבונים פלואורסצנט עניין. כדי לחקור אינטראקציות של שני המינים חלבון שונה שכותרתו, הרכישה מתבצעת בשני ערוצים ספקטרלי באמצעות שני קווי לייזר, שני חלונות איתור עבור fluorophores spectrally מופרדים. בשל הדינמיקה דיפוזיה איטית של חלבונים ברה מ (D≤ ~ 1 /s²מיקרומטר), מידה קרוס-לדבר נטול יכול להתבצע על ידי לסירוגין את ערכת עירור משורת בשורה¹⁵. הניתוח מתחיל עם: 1) תיקון אלגוריתם יישור לתנועה לרוחב התא מבוסס על block-wise בממוצע של ~ 1000 שורות, 2) קביעת המיקום עם פלורסצנטיות המרביכלומר הממשלה מיקום האות, בכל בלוק, 3) הסטה של כל הבלוקים על נפוצות מקור^12,15, בנפרד בכל אחד מהערוצים. לאחר מכן, מבחר אוטומטית של פיקסלים רה מ מתבצע על-ידי בחירה באזור המרכז התאמה לפי עקומת גאוס הסיכום של כל הקווים מיושר (קרי, מרכז ± 2.5σ). שילוב של האותות בכל שורה התשואות ממברנה פלורסצנטיות סדרת הזמן F(t) בכל אחד מהערוצים (g = ירוק ערוץ, r = הערוץ האדום). שים לב כי גודל פיקסל חייב להיות קטן מספיק, למשל, < 200 ננומטר, לשחזר את צורת הנקודה להפיץ את הפונקציה ולמצוא את המרכז שלו, המתאים למיקום של ראש הממשלה. בנוכחות photobleaching משמעותית, סדרת הזמן פלורסצנטיות בכל אחד מהערוצים ייתכן המודל עם פונקציה מעריכית-כפול ויש לאחר מכן תוקן עם הנוסחה הבאה:¹⁶

.    (1)

חשוב לציין כי נוסחה זו מתקנת ביעילות amplitudes והן דיפוזיה פעמים המתקבל ניתוח המתאם של F(t)^c, לעומת הערכות פרמטר זה ניתן להשיג את שלא תוקנו F(t). ואז, הפונקציות אוטומטי – ואת הצלב-קורלציה (ACFs / CCFs) של קרינה פלואורסצנטית החישוב של אותות:

, (2).

, (3).

איפה אלפאF_אני = F_אני(t) – F_אני(t) , ואני = g, r.

מודל דו מימדי דיפוזיה מצויד ואז המתאם לכל הפונקציות (CFs):

.   (4)

כאן, N מציין את מספר חלבונים פלורסנט אמצעי תצפית, τ_d הזמן דיפוזיה לכל ערוץ. מודל זה לוקח בחשבון כי בהגדרה ניסיוני המתואר, דיפוזיה של חלבונים ברה מ מתרחשת בתוך המטוס x-z, בניגוד נפוץ התצורה של המתאם פלורסצנטיות ספקטרוסקופיה (FCS) ניסויים ממברנות חיטוט דיפוזיה במישור x-y של נפח קונאפוקלית¹⁷. המותניים w₀ והגורם מבנה S, המתארת את התארכות w_z של אמצעי האחסון נקודתית ב- z, S = w_z/w₀, מתקבלים מ כיול נקודת FCS מדידה המבוצעת עם spectrally דומים צבעי והגדרות באותו האופטי באמצעות הערכים הזמינים כבר מקדם דיפוזיה D_צבע:

, (5).

איפה τ_{d, צבע} זה הזמן נמדד פיזור ממוצע של מולקולות צבען, המתקבל מתאים למודל תלת מימדי דיפוזיה בנתונים, לוקח לתוך חשבון מעברים של השבר T של כל המולקולות N שלישיה המדינה עם קבוע הזמן τ_τ:

.   (6)

לבסוף, דיפוזיה (D), ערכי הבהירות מולקולרית (חדוה) והקבוע יחסית קרוס-הקורלציה של נתונים sFCCS (rel.cc.) מחושבים כדלהלן:

, (7).

, (8).

, (9).

G_קרוס(0) איפה משרעת הפונקציה קרוס-קורלציה, הוא משרעת הפונקציה autocorrelation בערוץ אני-th.

הגדרה זו של יחסי קרוס-המתאם, קרי שימוש מרבי במקום כלומר המשוואה 9, לוקח בחשבון את המספר המרבי של קומפלקסים של חלבונים שני מינים נוכח בריכוזים שונים הוא מוגבל על ידי מינים נוכח מספר נמוך יותר.

בהירות ומספר צלב-המתאם מבוסס על ניתוח רגע של עוצמת קרינה פלואורסצנטית לכל פיקסל של אוסף תמונות רכשה במשך הזמן במיקום קבוע במדגם, המורכב בדרך כלל ~ 100-200 מסגרות, עם שני ספקטרלי ערוצי ( g = ירוק ערוץ, r = הערוץ האדום). מהממוצע טמפורלית אני_{, ואני השונות} , הבהירות מולקולרית חדוה_i ואת מספר n_אני מחושבים ב כל פיקסל וערוץ ספקטרלי (אני = g, r)¹⁸:

, (10).

. (11)

חשוב לציין כי המשוואות נתון חלים במקרה האידיאלי של גלאי ספירת פוטון אמיתי. עבור מערכות זיהוי אנלוגי, המשוואות הבאות חלות^19,20:

, (12).

.   (13)

כאן, S הוא הגורם המרה בין פוטונים שזוהו הסעיפים דיגיטלי מוקלטות, הוא רעש readout ואת היסט מתייחס ההיסט בעוצמה גלאי. באופן כללי, כמויות אלה צריכים להיות מכויל, עבור כל סוג הגלאי, המבוססת על מדידת השונות גלאי כפונקציה של עוצמת תאורה קבועה¹⁹, למשל, משטח מתכת רעיוני או פתרון דיי יבשים. היסט יכול להיקבע על ידי מדידת שיעור ספירה עבור דגימה ללא עירור אור. על ידי ביצוע רגרסיה ליניארית של השונות הקשורות גלאי לעומת העוצמה (אני) העלילה, S ו יכול להיות נחוש¹⁹:

.   (14)

בסופו של דבר, הבהירות קרוס-המתאם מחושב בתוך כל פיקסל ולא מוגדר באופן כללי כמו²¹

, (15).

איפה הוא קרוס-השונות .

על מנת לסנן תנודות חיים ארוכים, כל ccN & B החישובים מבוצעים בעקבות קרון מטען סינון, באופן עצמאי עבור כל פיקסל²². בקצרה, n_i, חדוה_אני (אני = g, r) ו- B_cc מחושבים בהזזה מקטעים של למשל, 8-15 מסגרות. הערכים שהושג ובכך להיות בממוצע אז כדי להשיג הפיקסל האחרון מספר וערכי בהירות.

ניתוח סטויכיומטריה
כדי לאמוד את סטויכיומטריה של חלבון מתחמי תא-תא באנשי קשר, הבהירות מולקולרית ניתן בנפרד לנתח בכל אחד מהערוצים ספקטרליות עבור sFCCS או ccN & B נתונים. ב- sFCCS, מתקבל ערך הבהירות אחד לכל מדידה בכל ערוץ. ב ccN & B, היסטוגרמה הבהירות של פיקסלים כל הקשר תא-תא מתקבל, הערך הממוצע (או החציוני) יכול לשמש נציג בהירות למדידה. על ידי ביצוע הניתוח אותו על הפניה monomeric, כל ערכי הבהירות יכול להיות מנורמל להשיג ישירות מדינת oligomeric הממוצע מתחמי חלבון שזוהו. בנקודה זו, חשוב לתקן לנוכחות של FPs שאינו-פלורסנט שעלולים לגרום underestimation המדינה oligomeric. זה מתבצע בדרך כלל על ידי מודדים את הבהירות הפניה ההומו-dimeric חלבון^23,24 באמצעות sFCS צבע אחד או מספר והבהירות (N & B).

Protocol

1. הכנה לדוגמה: תא-תא ערבוב Assay הערה: פרוטוקול הבאים מתאר את תהליך ערבוב עבור תאים חסיד. זה עשוי להיות שונה עבור תאים תרבותי ההשעיה. זרע מספר מתאים של תאים על צלחת 6-ובכן, למשל, 800,000 HEK 293T תאים (החשבת נויבאואר ספירת קאמרית), יום לפני תרביות תאים. המספר שניתן לשנות בהתאם הז…

Representative Results

מבחן ראשון עבור אינטראקציית חלבון-חלבון וזמינותו, קרי, ערבוב של תאים המבטאים חלבונים פלורסנט ברורים spectrally, ואחריו sFCCS/ccN & B מדידות (איור 1), צריכה להתבצע על חלבונים אשר אינם אמורים אינטראקציה-הקשר תא-תא (קרי, פקד שלילי). לכן, HEK 293T תאים myristoylated-palmitoylated-…

Discussion

ההליך ניסיוני המתוארים כאן מאפשר החקירה של חלבון טרנס אינטראקציות תא-תא באנשי קשר, העסקת פלורסצנטיות תנודות ספקטרוסקופיה טכניקות, כלומר sFCCS, ccN & B. שיטות אלה כוללות ניתוח סטטיסטי של תנודות פלורסצנטיות הנפלטים על ידי שני FPs spectrally מופרדים דבוקה protein(s) עניין אצל איש קשר של שני תאים סמוכים, …

Materials

DMEM growth medium	PAN-Biotech	P04-01548
DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+	PAN-Biotech	P04-36500
DPBS w: Ca2+ and Mg2+	PAN-Biotech	P04-35500
Trypsin EDTA	PAN-Biotech	P10-023100
TurboFect Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	R0531
HEK 293T cells	DSMZ	ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS Ester	Thermo Fisher Scientific	A20000
Rhodamine B	Sigma-Alderich	83689-1G
Plasmid DNA	Addgene	NA	See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids
6-well plate	Starlab	CC7672-7506
35-mm glass bottom dishes	CellVis	D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 confocal	Carl Zeiss	NA
MATLAB software package	MathWorks	2015b
Neubauer cell counting chamber	Marienfeld	640110