Analys av Actomyosin dynamik på lokala cellulära och vävnad skalor med hjälp av Time-lapse filmer av odlade Drosophila ägg kammare
Summary
Detta protokoll ger en Fiji-baserade, användarvänlig metod tillsammans med enkla instruktioner som förklarar hur man tillförlitligt analysera aktomyosin beteende i enskilda celler och böjda epitelial vävnader. Inga programmeringskunskaper krävs för att följa handledningen; alla steg utförs på ett semi-interaktivt sätt med hjälp av det grafiska användargränssnittet för Fiji och tillhörande insticksprogram.
Abstract
Drosophila omogna ägg kallas ägg kammare, och deras struktur liknar primitiva organ som genomgår morfologiska förändringar från en runda till en ellipsoid form under utvecklingen. Denna utvecklingsprocess kallas oogenes och är avgörande för att generera funktionella mogna ägg för att säkra nästa fluga generation. Av dessa skäl har Egg Chambers fungerat som en idealisk och relevant modell för att förstå utvecklingen av djurens organ.
Flera in vitro-culturingprotokoll har utvecklats, men det finns flera nackdelar med dessa protokoll. En innebär tillämpning av olika omslag som utövar ett konstgjort tryck på avbildade ägg kammare för att immobilisera dem och öka den avbildade förvärvs plan av omkretsriktningen ytan av de analyserade ägg kamrarna. Ett sådant tillvägagångssätt kan negativt påverka beteendet hos den tunna aktomyosin maskiner som genererar kraften att rotera ägg kammare runt deras längre axel.
Således, för att övervinna denna begränsning, vi kultur Drosophila ägg kammare fritt i medierna för att tillförlitligt analysera aktomyosin maskiner längs omkretsen av ägg kammare. I den första delen av protokollet, ger vi en manual som beskriver hur man analyserar aktomyosin maskiner i ett begränsat anskaffnings plan på den lokala cellulära skalan (upp till 15 celler). I den andra delen av protokollet, vi förse användare med en ny Fiji-baserade plugin som gör det enkelt utvinning av ett definierat tunt skikt av ägget kamrarna omkretsriktningen yta. Följande protokoll beskriver sedan hur man analyserar aktomyosin signaler på vävnads skalan (> 50 celler). Slutligen, vi precisera begränsningarna av dessa metoder på både lokala cellulära och vävnads skalor och diskutera dess potentiella framtida utveckling och möjliga tillämpningar.
Introduction
Den ständiga utvecklingen av nya avbildnings-och programvaruteknologier med tillämpningar inom Life Sciences har gett en enorm inverkan på förståelsen av livets grundläggande principer. En av de största utmaningarna är den pålitliga visualiseringen av utvecklingsprocesser i kombination med deras levande avbildning i olika vävnader. Vävnader är delar av organ och organ och, som sådan, majoriteten är inte lätt tillgängliga för avbildning. Därför har protokoll som gör att deras dissektion och in vitro-odling har utvecklats för att visualisera biologiska händelser som i tillräcklig utsträckning återspeglar den in vivo situationen inom en levande kropp.
Under de senaste decennierna har odling och levande avbildning av Drosophila ägg kammare, acinar-liknande strukturer som liknar primitiva organ, bidragit oerhört till förståelsen av de grundläggande principerna för primitiv orgel utveckling1 , 2 , 3. för närvarande finns det flera odlings protokoll tillgängliga, och deras användning beror på förvärvs tid, celltyp som ska avbildas, och deras tillgänglighet (t. ex. inre köns cells kontra yttre somatisk linje)4.
Ett vanligt inslag i alla dessa odlings protokoll är behovet av immobilisering av analyserade ägg kammare som visar en hög kontraktila aktivitet i flytande media. Den kontraktila aktiviteten av ägg kammare orsakas främst av muskeln arket som täcker en lång rad anslutna ägg kammare5,6,7. Därför, för att uppnå korrekt immobilisering av unga ägg kammare, olika metoder har utvecklats, som omfattar täcker ägg kammare med täckglas6,8,9 eller flexibla filtar4, 10 eller bädda in dem i låg-smältande-punkt aguppstod3,11. Dessa metoder är populära eftersom de också tillåter avbildning av ett större visuellt plan på grund av den subtila tillplattning av omkretsriktningen ytan av ägget kamrarna.
Emellertid, nyligen, det har visat sig att unga ägg kammare (etapp 1-8) rotera runt deras främre-posterior axel6 och att denna vävnad rörelse drivs av en fin aktomyosin nätverk nära omkretsriktningen ytan av dessa unga ägg kammare 12. därför kan konstgjord förändring av den cellulära ytan orsakad av en subtil tillplattning av denna vävnad ha en negativ inverkan på beteendet hos den kraft som genererar aktomyosin maskiner. Den kontrapunkt är att om ägget kammaren vävnad inte är tillplattad, mikroskopisk avbildning av proteiner på omkretsriktningen ytan av ägg kammare blir ännu mer begränsad av den minskade storleken på förvärvet planet.
Därför har vi kombinerat protokoll från Prasad et al.9 och labbet i Celeste berg4,10 och ytterligare modifierade dem så att ingen täckslip/flexibel filt/aguppstod används i den utvecklade metoden. Drosophila ägg kammare är fritt odlade i media och det protokoll som presenteras här gäller endast inverterad mikroskopi. Det finns två delar i protokollet. Den första delen är inriktad på analys av aktomyosin signaler på den lokala cellulära skalan (upp till 15 celler) inom ägg kammare. I den andra delen fokuserar vi på att övervinna de begränsningar som är förknippade med ett litet förvärvs plan som orsakas av fri odling av ägg kammare. I detta avseende har vi utvecklat en roman Fiji-baserad beräkningsmetod med ett semi-interaktivt grafiskt användargränssnitt som selektivt extraherar och vecklar ut definierade skikt av en omkrets vävnad yta. Detta följs av ett protokoll som beskriver hur man analyserar aktomyosin på vävnads skalan (dvs > 50 celler). Eftersom selektiv extraktion av ett definierat tunt skikt av böjda epitelvävnader inte har varit lätt möjligt med hjälp av en klassisk z-stack projektion (figur 1), denna lättanvända metod fungerar som en viktig förutsättning för att på ett heltäckande sätt förstå beteende av en tunn (< 1 μm) aktomyosin nätverk på vävnads skalan i Drosophila ägg kammare.
Dessutom, för att underlätta protokollet, ger vi exempel på Time-lapse filmer (TLMs) och exempelfiler av Fluorescent taggade nonmuscle konventionella myosin II beteende (se kompletterande fil 3). Myosin II är ett motor protein och representerar den aktiva kontraktila delen av aktomyosin maskiner. För att bild myosin II, använder vi Drosophila transgena linjer som innehåller en modifierad regel ljus kedja av myosin II kallas mrlc:: GFP (se tabell över material för detaljer)12,13. För att visualisera cellmembran, är protokollet baserat på kommersiella färgämnen (se tabell över material). Detta protokoll lämpar sig inte bara för analys av små subcellulära mrlc:: GFP signaler12 men också för alla liknande stora subcellulära partiklar runt ± 300 μm, såsom de som observerats med Life-Act:: GFP12,14.
Även om båda dessa protokoll presenteras med hjälp av in vitro odlade Drosophila ägg kammare, kan förvärvet av aktomyosin signaler också utföras med hjälp av andra vävnader på optimering av odlingsmedier och beroende på tillgängligheten av antingen Fluorescent märkta proteiner med motsvarande kommersiella färgämnen eller, till exempel, mRNA mikroinjektioner för att få övergående genuttrycksprofiler. På samma sätt kan det Fiji-baserade protokollet för utvinning av ett tunt lager från en omkretsriktningen yta appliceras mer allmänt på ellipsoid och orgel-liknande vävnader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska steg och felsökning för dissektion och odling av ägg kammare
Om alltför många flugor är placerade i en liten flaska, kan flugan vända leriga efter 2-3 dagar på grund av omfattande mängder av utfodring larver och vuxna flugor fastnar i flugan mat. I ett sådant fall, Vänd resten av dessa flugor i en ny flaska med färsk mat och trappa ner deras antal. I synnerhet utesluta kvinnor som fastnat i maten.
Den Schneider mix (SM) bör fö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna är mycket tacksamma till Miriam Osterfield för att dela hennes råd om in vitro liv avbildning av ägg kammare med hjälp av en strategi som antogs från Celeste berg Laboratory4. Vi tackar också Sebastian Tosi för Fiji script som möjliggör cellsegmentering.
Materials
| Schneider Medium | Gibco | 21720-024 | [+]-Glutamine |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | [+] 10.000 Units/ml Penicillin [+] 10.000 µg/ml Streptomycin |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F135 | Heat inactivated |
| Insulin Solution Human | Sigma | I9278 | |
| 50 ml Falcon tubes | Eppendorf | sterile | |
| Millex-GV filter | Millipore | SLGV033NS | 33 mm |
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass |
| Forceps | A. Dumont & Fils | #55 | |
| CellMask Deep Red (cell membrane dye) | Invitrogen | C10046 | |
| FM4-64 (cell membrane dye) | ThermoFisher/Invitrogen | T13320 | |
| Depression dissection slide | Fisher Scientific | 12-560B | |
| Microscopic equipment | |||
| Steromicroscope | e.g. Zeiss | Stemi SV 6 | |
| Inverted confocal microscope | e.g. Zeiss/Olympus | ||
| Spinning disc microscope | e.g. Zeiss/Andor | ||
| Microscopic glass/cover glass | e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas | ||
| Cactus tool | |||
| Wironit needle holder | Hammacher | 9160020 | |
| Cactus spine | Echinocactus grusonii/barrel cactus | ||
| Drosophila stocks used in the manuscript | |||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP | For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115. | ||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat103C | For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107. |
References
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68, 207-217 (2014).
- Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries. Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).
- Peters, N. C., Berg, C. A. In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method. Methods of Molecular Biology. , 35-68 (2016).
- Spradling, A. C., Bate, M., Arias, A. M. Developmental Genetics of Oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1. , 1-70 (1993).
- Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
- Andersen, D., Horne-Badovinac, S. Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila. Development. 143, 1375-1387 (2016).
- Pokrywka, N. J. Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50044 (2013).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
- Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. 발생학. 267, 320-341 (2004).
- Cetera, M., et al. Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation. Nature Communications. 5, 5511 (2014).
- Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLOS Genetics. 13, e1007107 (2017).
- Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468, 1110-1114 (2010).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. 발생학. 393, 209-226 (2014).
- . Surface manager Available from: https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager (2018)
- . Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies Available from: https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins (2018)
- . BigDataViewer Available from: https://imagej.net/BigDataViewer (2017)
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
- Turner, C. M., Adler, P. N. Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila. Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).
- Heemskerk, I., Streichan, S. J. Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction. Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).
- Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity. Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
