Analyse af Actomyosin dynamik på lokale cellulære og vævs skalaer ved hjælp af time-lapse film af dyrkede Drosophila ægge kamre
Summary
Denne protokol giver en Fiji-baseret, brugervenlig metode sammen med ligetil instruktioner, der forklarer, hvordan man pålideligt analysere actomyosin adfærd i individuelle celler og buede epiteliale væv. Ingen programmering færdigheder er forpligtet til at følge tutorial; alle trin udføres på en semi-interaktiv måde ved hjælp af den grafiske brugergrænseflade af Fiji og tilhørende plugins.
Abstract
Drosophila umodne æg kaldes ægge kamre, og deres struktur ligner primitive organer, der gennemgår morfologiske ændringer fra en runde til en ellipsoide form under udvikling. Denne udviklingsmæssige proces kaldes oogenesen og er afgørende for at generere funktionelle modne æg til at sikre den næste flue generation. Af disse grunde har ægkamre tjent som en ideel og relevant model til at forstå dyrs orgel udvikling.
Flere in vitro-dyrknings protokoller er blevet udviklet, men der er flere ulemper ved disse protokoller. Den ene indebærer anvendelse af forskellige dækker, der udøver et kunstigt pres på de afbildet æg kamre for at imurre dem og at øge den afbildet erhvervelse flyet af den circumferentielle overflade af de analyserede æg kamre. En sådan fremgangsmåde kan have en negativ indflydelse på adfærden af de tynde actomyosin maskiner, der genererer kraften til at rotere ægkamre omkring deres længere akse.
Således, at overvinde denne begrænsning, vi kultur Drosophila æg kamre frit i medierne for at pålideligt analysere actomyosin maskiner langs omkredsen af ægge kamre. I den første del af protokollen, giver vi en manual beskriver, hvordan man analyserer actomyosin maskiner i en begrænset erhvervelse flyet på den lokale cellulære skala (op til 15 celler). I den anden del af protokollen, giver vi brugerne en ny Fiji-baseret plugin, der giver mulighed for simpel udvinding af et defineret tyndt lag af ægget kamre ‘ circumferential overflade. Følgende protokol beskriver derefter, hvordan actomyosin-signaler analyseres i vævs skalaen (> 50 celler). Endelig, vi udpege begrænsningerne af disse tilgange på både den lokale cellulære og vævs skalaer og diskutere dens potentielle fremtidige udvikling og mulige applikationer.
Introduction
Den stadige udvikling af nye billeddannelses-og softwareteknologier med anvendelser i biovidenskaben har givet en enorm indflydelse på forståelsen af livets grundlæggende principper. En af de største udfordringer er den pålidelige visualisering af udviklingsmæssige processer i kombination med deres levende billeddannelse i forskellige væv. Væv er dele af organer og organer, og som sådan er flertallet ikke let tilgængelige for billeddannelse. Derfor er protokoller, der tillader deres dissektion og in vitro-dyrkning blevet udviklet med henblik på at visualisere biologiske hændelser, der i tilstrækkelig grad afspejler in vivo-situationen i en levende krop.
I løbet af de seneste årtier, dyrkning og levende billeddannelse af Drosophila ægge kamre, acinar-lignende strukturer, der ligner primitive organer, har bidraget enormt til forståelsen af de grundlæggende principper for primitiv orgel udvikling1 , 2 , 3. i øjeblikket er der flere dyrkning protokoller til rådighed, og deres anvendelse afhænger af erhvervelse tid, celletype, der skal imaged, og deres tilgængelighed (f. eks indre kimcelle vs. ydre somatiske linje)4.
Et fælles træk i alle disse dyrkning protokoller er behovet for immobilisering af analyserede æg kamre, der viser en høj kontraktile aktivitet i flydende medier. Den kontraktile aktivitet af ægge kamre er forårsaget hovedsageligt af musklen ark, der dækker en lang række tilsluttede ægkamre5,6,7. For at opnå en korrekt immobilisering af unge ægkamre er der derfor udviklet forskellige tilgange, som omfatter ægkamre med dæksedler6,8,9 eller fleksible tæpper4, 10 eller indlejring dem i lav-smeltepunkt agopstået3,11. Disse tilgange er populære, da de også giver mulighed for billeddannelse af en større visuel plan på grund af den subtile fladning af den circumferentielle overflade af ægge kamre.
Men for nylig har det vist sig, at unge ægkamre (etape 1-8) roterer omkring deres forreste-posterior akse6 , og at denne vævs bevægelse drives af et fint actomyosin-netværk tæt på den omskiftelige overflade af disse unge ægkamre 12. derfor kan kunstig ændring af cellulær overflade forårsaget af en subtil udfladning af dette væv have en negativ indvirkning på adfærden af den kraft skabende actomyosin maskiner. Kontra pointet er, at hvis ægkammer vævet ikke er fladtrykt, bliver mikroskopisk billeddannelse af proteiner på ægkammerets circumferentielle overflade endnu mere begrænset af den nedsatte størrelse af anskaffelses planet.
Derfor har vi kombinerede protokoller fra Prasad et al.9 og laboratoriet i Celeste Berg4,10 og yderligere modificeret dem, så der ikke er nogen coverslip/fleksibel tæppe/agantet anvendes i den udviklede metode. Drosophila ægge kamre er frit kultiveret i medierne og protokollen præsenteres her gælder kun inverteret mikroskopi. Der er to dele af protokollen. Den første del er fokuseret på analysen af actomyosin signaler på den lokale cellulære skala (op til 15 celler) i ægge kamre. I den anden del, vi fokuserer på at overvinde de begrænsninger, der er forbundet med en lille erhvervelse fly forårsaget af den frie dyrkning af ægge kamre. I denne forbindelse har vi udviklet en roman Fiji-baseret Computational metode med en semi-interaktiv grafisk brugergrænseflade, der selektivt ekstrakter og udfolder definerede lag af en circumferentiel vævs overflade. Dette efterfølges af en protokol, der beskriver, hvordan man analyserer actomyosin på vævs skalaen (dvs. > 50 celler). Da den selektive ekstraktion af et afgrænset tyndt lag af buet epitelial væv ikke har været let mulig ved hjælp af en klassisk z-stak projektion (figur 1), er denne brugervenlige metode en vigtig forudsætning for en grundig forståelse af opførsel af en tynd (< 1 μm) actomyosin netværk på vævs skalaen i Drosophila ægge kamre.
Hertil kommer, at lette protokollen, vi giver eksempel time-lapse film (TLMs) og prøve filer af fluorescently Tagged nonmuscle konventionel myosin II adfærd (Se supplerende fil 3). Myosin II er et motor protein og repræsenterer den aktive kontraktile del af actomyosin-maskinerne. For at billedet myosin II, vi bruger Drosophila transgene linjer, der indeholder en modificeret lovgivningsmæssig lyskæde af myosin II kaldet mrlc:: gfp (Se tabel over materialer for detaljer)12,13. For at visualisere cellemembraner er protokollen baseret på kommercielle farvestoffer (Se tabel over materialer). Denne protokol er egnet ikke kun til analyse af små subcellulære mrlc:: gfp signaler12 men også for enhver lignende størrelse subcellulære partikler omkring ± 300 μM, såsom dem observeret med Life-Act:: gfp12,14.
Selv om begge disse protokoller er præsenteret ved hjælp in vitro kulturperler Drosophila æg kamre, erhvervelse af actomyosin signaler kan også udføres ved hjælp af andre væv på optimering af de dyrkning medier og afhængigt af tilgængeligheden af enten fluorescently mærkede proteiner med tilsvarende kommercielle farvestoffer eller, for eksempel, mRNA mikroinjektioner for at opnå transitorisk genekspression profiler. På samme måde kan den Fiji-baserede protokol til udvinding af et tyndt lag fra en circumferentiel overflade anvendes mere generelt til ellipsoide og orgel lignende væv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trin og fejlfinding for dissektion og dyrkning af ægkamre
Hvis alt for mange fluer er placeret i et lille hætteglas, kan flue maden blive mudret efter 2 – 3 dage på grund af omfattende mængder af fodring larver og voksne fluer at blive fanget i flue mad. I et sådant tilfælde, flip resten af disse fluer i et nyt hætteglas med frisk mad og downsize deres antal. Især udelukke kvinder, der sad fast i maden.
Schneider mix (SM) skal til…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er meget taknemmelige for Miriam Osterfield for at dele hendes råd om in vitro Life Imaging af ægge kamre ved hjælp af en tilgang, der er vedtaget fra Celeste Berg laboratorium4. Vi takker også Sebastian Tosi for Fiji scriptet, der muliggør celle segmentering.
Materials
| Schneider Medium | Gibco | 21720-024 | [+]-Glutamine |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | [+] 10.000 Units/ml Penicillin [+] 10.000 µg/ml Streptomycin |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F135 | Heat inactivated |
| Insulin Solution Human | Sigma | I9278 | |
| 50 ml Falcon tubes | Eppendorf | sterile | |
| Millex-GV filter | Millipore | SLGV033NS | 33 mm |
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass |
| Forceps | A. Dumont & Fils | #55 | |
| CellMask Deep Red (cell membrane dye) | Invitrogen | C10046 | |
| FM4-64 (cell membrane dye) | ThermoFisher/Invitrogen | T13320 | |
| Depression dissection slide | Fisher Scientific | 12-560B | |
| Microscopic equipment | |||
| Steromicroscope | e.g. Zeiss | Stemi SV 6 | |
| Inverted confocal microscope | e.g. Zeiss/Olympus | ||
| Spinning disc microscope | e.g. Zeiss/Andor | ||
| Microscopic glass/cover glass | e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas | ||
| Cactus tool | |||
| Wironit needle holder | Hammacher | 9160020 | |
| Cactus spine | Echinocactus grusonii/barrel cactus | ||
| Drosophila stocks used in the manuscript | |||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP | For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115. | ||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat103C | For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107. |
References
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68, 207-217 (2014).
- Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries. Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).
- Peters, N. C., Berg, C. A. In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method. Methods of Molecular Biology. , 35-68 (2016).
- Spradling, A. C., Bate, M., Arias, A. M. Developmental Genetics of Oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1. , 1-70 (1993).
- Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
- Andersen, D., Horne-Badovinac, S. Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila. Development. 143, 1375-1387 (2016).
- Pokrywka, N. J. Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50044 (2013).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
- Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. 발생학. 267, 320-341 (2004).
- Cetera, M., et al. Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation. Nature Communications. 5, 5511 (2014).
- Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLOS Genetics. 13, e1007107 (2017).
- Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468, 1110-1114 (2010).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. 발생학. 393, 209-226 (2014).
- . Surface manager Available from: https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager (2018)
- . Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies Available from: https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins (2018)
- . BigDataViewer Available from: https://imagej.net/BigDataViewer (2017)
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
- Turner, C. M., Adler, P. N. Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila. Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).
- Heemskerk, I., Streichan, S. J. Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction. Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).
- Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity. Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
