Analisi delle dinamiche di Actomyosin su scale cellulari e tissutali locali utilizzando film time-lapse di camere d'uovo di Drosophila coltivate

Summary

Questo protocollo fornisce una metodologia fiji-friendly insieme a semplici istruzioni che spiegano come analizzare in modo affidabile il comportamento dell’actomyosina nelle singole cellule e nei tessuti epiteliali curvi. Non sono richieste competenze di programmazione per seguire il tutorial; tutti i passaggi vengono eseguiti in modo semi-interattivo utilizzando l’interfaccia utente grafica delle Fiji e dei plugin associati.

Abstract

Le uova immature della Drosophila sono chiamate camere d’uovo, e la loro struttura assomiglia agli organi primitivi che subiscono cambiamenti morfologici da una forma rotonda a una ellissoide durante lo sviluppo. Questo processo di sviluppo è chiamato oogenesi ed è fondamentale per generare uova mature funzionali per garantire la prossima generazione di mosche. Per questi motivi, le camere d’uovo sono servite come modello ideale e pertinente per comprendere lo sviluppo di organi animali.

Sono stati sviluppati diversi protocolli di coltura in vitro, ma questi protocolli presentano diversi svantaggi. Uno comporta l’applicazione di varie coperture che esercitano una pressione artificiale sulle camere d’uovo foto al fine di immobilizzarle e per aumentare il piano di acquisizione immaginato della superficie circonferenziale delle camere d’uovo analizzate. Tale approccio può influenzare negativamente il comportamento del sottile macchinario di actomiosina che genera il potere di ruotare le camere d’uovo intorno al loro asse più lungo.

Così, per superare questa limitazione, noi cultura Camere d’uovo Drosophila liberamente nei media al fine di analizzare in modo affidabile macchinari di actomyosina lungo la circonferenza delle camere d’uovo. Nella prima parte del protocollo, forniamo un dettaglio manuale su come analizzare il macchinario actomyosina in un piano di acquisizione limitato su scala cellulare locale (fino a 15 celle). Nella seconda parte del protocollo, forniamo agli utenti un nuovo plugin basato sulle Fiji che consente la semplice estrazione di uno strato sottile definito della superficie circonferenzale delle camere d’uovo. Il seguente protocollo descrive quindi come analizzare i segnali di actomiosina su scala tissutale (>50 cellule). Infine, abbiamo individuato i limiti di questi approcci sia per la rete cellulare locale che per i tessuti e discutiamo del suo potenziale sviluppo futuro e delle possibili applicazioni.

Introduction

Il continuo sviluppo di nuove tecnologie di imaging e software con applicazioni nelle scienze della vita ha fornito un enorme impatto sulla comprensione dei principi di base della vita. Una delle sfide principali è la visualizzazione affidabile dei processi di sviluppo in combinazione con la loro imaging dal vivo in vari tessuti. I tessuti sono parti di organi e corpi e, in quanto tali, la maggior parte non sono facilmente accessibili per l’imaging. Pertanto, sono stati sviluppati protocolli che consentono la loro dissezione e la loro coltura in vitro al fine di visualizzare eventi biologici che riflettono sufficientemente la situazione in vivo all’interno di un corpo vivente.

Negli ultimi decenni, la coltura e l’imaging dal vivo delle camere d’uovo della Drosophila, strutture simili acinari e simili a organi primitivi, ha contribuito immensamente alla comprensione dei principi di base dello sviluppo primitivo degli organi^{1 , 2 Il} nome del sistema ^{, 3}. Attualmente, ci sono diversi protocolli di coltura disponibili, e il loro utilizzo dipende dal tempo di acquisizione, tipo di cella da imageizzare, e la loro accessibilità (ad esempio, germinainterna e linea somatica esterna)⁴.

Una caratteristica comune in tutti questi protocolli di coltura è la necessità di immobilizzare le camere d’uovo analizzate che mostrano un’elevata attività contrattile nei supporti liquidi. L’attività contrattile delle camere d’uovo è causata principalmente dal foglio muscolare che copre una lunga serie di camere d’uovo collegate^5,6,7. Pertanto, per ottenere una corretta immobilizzazione delle camere d’uovo giovani, sono stati sviluppati vari approcci, che prevedono la copertura delle camere d’uovo con coperchi rivolti^6,8,9 o coperte flessibili^{4, 10} o incorporandoli in agarose a basso punto di fusione^3,11. Questi approcci sono popolari in quanto consentono anche l’imaging di un piano visivo più grande a causa del sottile appiattimento della superficie circonferenziale delle camere d’uovo.

Tuttavia, recentemente, è stato dimostrato che le camere delle uova giovani (stadio 1-8) ruotano intorno al loro asse anteriore-posteriore⁶ e che questo movimento del tessuto è alimentato da una rete di actomiosina fine vicino alla superficie circonferenziale di queste giovani camere ^{d’uovo 12}. Pertanto, l’alterazione artificiale della superficie cellulare causata da un sottile appiattimento di questo tessuto può avere un impatto negativo sul comportamento del meccanismo di actomiosina che genera forza. Il contrappunto è che se il tessuto della camera dell’uovo non è appiattito, l’imaging microscopico delle proteine sulla superficie circonferenziale delle camere d’uovo diventa ancora più limitato dalla diminuzione delle dimensioni del piano di acquisizione.

Pertanto, abbiamo combinato protocolli da Prasad et al.⁹ e il laboratorio di Berg Celeste^4,10 e ulteriormente modificato in modo che nessun coverslip / coperta flessibile / agarose viene utilizzato nel metodo sviluppato. Le camere delle uova di Drosophila sono liberamente coltivate nei media e il protocollo qui presentato si applica solo microscopia invertita. Ci sono due parti del protocollo. La prima parte è focalizzata sull’analisi dei segnali di actomiosina su scala cellulare locale (fino a 15 celle) all’interno delle camere d’uovo. Nella seconda parte, ci concentriamo sul superamento dei limiti associati a un piccolo piano di acquisizione causato dalla libera coltura delle camere d’uovo. A questo proposito, abbiamo sviluppato un nuovo metodo computazionale basato sulle Fiji con un’interfaccia utente grafica semi-interattiva che estrae e dispiega selettivamente strati definiti di una superficie del tessuto circonferenzale. Questo è seguito da un protocollo che descrive come analizzare l’actomiosina su scala tissutale (cioè, >50 cellule). Poiché l’estrazione selettiva di un sottile strato definito di tessuti epiteliali curvi non è stata facilmente possibile utilizzando una proiezione classica dello z-stack (Figura 1), questo metodo facile da usare funge da prerequisito importante per comprendere in modo completo il comportamento di una sottile rete di actomyosina (<1 m) su scala tissutale nelle camere d'uovo della Drosophila.

Inoltre, per facilitare il protocollo, forniamo esempi di filmati time-lapse (TLM) e file di esempio del comportamento di Myosin aI convenzionale con tag fluorescenti (vedere File supplementare 3). Myosin II è una proteina motoria e rappresenta la parte contrattile attiva del meccanismo di actomyosin. Per immaginare Myosin II, utilizziamo linee transgeniche della Drosophila che contengono una catena di luce regolatoria modificata di Myosin II chiamata MRLC::GFP (vedi Tabella dei Materiali per i dettagli)^12,13. Per visualizzare le membrane cellulari, il protocollo si basa su coloranti commerciali (cfr. Tabella deimateriali). Questo protocollo è adatto non solo per l’analisi dei piccoli segnali mrLC subcellulari::GFP^12, ma anche per particelle subcellulari di dimensioni simili intorno a 300 m, come quelle osservate con Life-Act::GFP^12,14.

Anche se entrambi questi protocolli sono presentati utilizzando camere d’uovo di Drosophila coltivate in vitro, l’acquisizione di segnali di actomiosina può essere eseguita anche utilizzando altri tessuti sull’ottimizzazione dei supporti di coltura e a seconda della disponibilità di proteine con etichettaflue fluorescenti con coloranti commerciali corrispondenti o, ad esempio, microiniezioni di mRNA per ottenere profili di espressione genica transitoria. Allo stesso modo, il protocollo basato su Fiji per l’estrazione di uno strato sottile da una superficie circonferenziale può essere applicato più in generale ai tessuti ellissoidi e simili ad organi.

Protocol

NOT:</ Il seguente protocollo fornisce istruzioni su come analizzare l’actomiosina al cellulare locale e la scala del tessuto nelle camere d’uovo della Drosophila. L’approccio su scala locale consente agli utenti di analizzare il comportamento dettagliato della actomiosina in un massimo di 15 celle per camera d’uovo e richiede l’acquisizione di TLM per un breve periodo di tempo (5-10 min) utilizzando immagini ad alta velocità e un microscopio confocale invertito. Al contrario, la scala tissutale f…

Representative Results

Questo protocollo consente agli scienziati di studiare il comportamento delle reti di actomyosina nei tessuti epiteliali. Ciò è possibile solo quando un’analisi dettagliata del comportamento dell’actomiosina su scala cellulare locale (alcune cellule) è combinata con un’analisi simile su scala tissutale (molte cellule). Tuttavia, i tessuti epiteliali sono spesso curvi e l’estrazione di uno strato sottile di questi tessuti in precedenza non era facilmente possibile, come mostrato nelle c…

Discussion

Passaggi critici e risoluzione dei problemi per la dissezione e la coltura delle camere d’uovo

Se troppe mosche vengono poste in una piccola fiala, il cibo a mosca può diventare fangoso dopo 2-3 giorni a causa di ampie quantità di larve di alimentazione e mosche adulte intrappolate nel cibo a mosca. In tal caso, capovolgere il resto di queste mosche in una nuova fiala con cibo fresco e ridimensionare il loro numero. In particolare, escludere le femmine che erano bloccate nel…

Materials

Schneider Medium	Gibco	21720-024	[+]-Glutamine
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	[+] 10.000 Units/ml Penicillin [+] 10.000 µg/ml Streptomycin
Fetal Bovine Serum	Sigma	F135	Heat inactivated
Insulin Solution Human	Sigma	I9278
50 ml Falcon tubes	Eppendorf		sterile
Millex-GV filter	Millipore	SLGV033NS	33 mm
Glass Bottom Microwell Dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass
Forceps	A. Dumont & Fils		#55
CellMask Deep Red (cell membrane dye)	Invitrogen	C10046
FM4-64 (cell membrane dye)	ThermoFisher/Invitrogen	T13320
Depression dissection slide	Fisher Scientific	12-560B
Microscopic equipment
Steromicroscope	e.g. Zeiss		Stemi SV 6
Inverted confocal microscope	e.g. Zeiss/Olympus
Spinning disc microscope	e.g. Zeiss/Andor
Microscopic glass/cover glass	e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
Wironit needle holder	Hammacher	9160020
Cactus spine	Echinocactus grusonii/barrel cactus
Drosophila stocks used in the manuscript
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP			For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat103C			For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.