배양 된 초파리 계란 챔버의 시간 경과 영화를 사용하여 로컬 세포 및 조직 저울에서 Actomyosin 역학분석
Summary
이 프로토콜은 개별 세포 및 곡선 상피 조직에서 actomyosin 행동을 안정적으로 분석하는 방법을 설명하는 간단한 지침과 함께 피지 기반의 사용자 친화적 인 방법론을 제공합니다. 자습서를 따르기 위해 프로그래밍 기술이 필요하지 않습니다. 모든 단계는 피지와 관련 플러그인의 그래픽 사용자 인터페이스를 사용하여 반 대화 형 방식으로 수행됩니다.
Abstract
초파리 미성숙 계란이라고 하는 계란 챔버, 그리고 그들의 구조는 개발 하는 동안 타원형 모양에 둥근에서 형태 변화를 겪는 원시 장기를 닮은. 이 발달 과정은 oogenesis에게 불리고 다음 플라이 세대를 확보하기 위하여 기능적인 성숙한 계란을 생성하는 것이 중요합니다. 이러한 이유로, 계란 챔버동물 장기 발달을 이해하는 이상적이고 관련 있는 모형으로 봉사했습니다.
몇몇 시험관 내 배양 프로토콜이 개발되었지만, 이러한 프로토콜에는 몇 가지 단점이 있다. 하나는 그들을 고정하고 분석 된 계란 챔버의 원주 표면의 이미지 획득 평면을 증가시키기 위해 이미지 계란 챔버에 인공 압력을 가하는 다양한 커버의 적용을 포함한다. 이러한 접근법은 더 긴 축을 중심으로 계란 챔버를 회전시키는 힘을 생성하는 얇은 아토미오신 기계의 거동에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
따라서, 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 알 챔버의 둘레를 따라 아토미오신 기계를 안정적으로 분석하기 위해 배지에서 Drosophila 난자 챔버를 자유롭게 배양한다. 프로토콜의 첫 번째 부분에서는 로컬 셀룰러 스케일(최대 15셀)에서 제한된 획득 평면에서 actomyosin 기계를 분석하는 방법을 자세히 설명하는 매뉴얼을 제공합니다. 프로토콜의 두 번째 부분에서, 우리는 계란 챔버의 원주 표면의 정의 된 얇은 층의 간단한 추출을 허용 하는 새로운 피지 기반 플러그인을 사용자에 게 제공. 다음 프로토콜은 조직 규모에서 actomyosin 신호를 분석하는 방법을 설명합니다 (>50 세포). 마지막으로, 우리는 현지 세포 및 조직 규모 둘 다에 있는 이 접근의 한계를 찾아내고 그것의 잠재적인 미래 발달 및 가능한 응용을 토론합니다.
Introduction
생명 과학 분야의 응용 분야와 함께 새로운 이미징 및 소프트웨어 기술의 지속적인 발전은 삶의 기본 원리를 이해하는 데 엄청난 영향을 미쳤습니다. 주요 과제 중 하나는 다양한 조직에서 의 한 번의 생생한 이미징과 함께 개발 과정의 신뢰할 수 있는 시각화입니다. 조직은 기관 및 바디의 부분이고, 이와 같이, 대다수는 화상 진찰을 위해 쉽게 접근할 수 없습니다. 따라서, 그들의 해부 및 시험관 내 배양을 허용하는 프로토콜은 생체 내의 생체 내 상황을 충분히 반영하는 생물학적 사건을 시각화하기 위해 개발되었다.
지난 수십 년 동안, 초원성 기관 을 닮은 acinar 같은 구조, Drosophila 계란 챔버의 배양 및 라이브 이미징, 원시 장기 개발의 기본 원칙의 이해에 대단히 기여하고있다1 , 2개 , 3. 현재, 사용할 수있는 몇 가지 배양 프로토콜이 있으며, 그 사용은 수집 시간, 이미지 할 세포 유형 및 접근성 (예를 들어, 내부 생식선 대 외부 체세포 선)에 따라 달라집니다4.
이러한 모든 배양 프로토콜의 일반적인 특징은 액체 매체에서 높은 수축 활성을 나타내는 분석 된 계란 챔버의 고정에 대한 필요성입니다. 계란 챔버의 수축 활성은 주로 연결된 계란 챔버 5,6,7의긴 문자열을 덮는 근육 시트에 의해 발생합니다. 따라서, 젊은 계란 챔버의 적절한 고정을 달성하기 위해, 다양한 접근 방식은 커버립 6,8,9 또는 유연한 담요4,커버 립과 계란 챔버를 덮고 포함, 개발되었다. 도 10 또는 저융점 아가로즈3,11에포함. 이 접근은 또한 계란 약실의 원주 표면의 미묘한 평평하게 때문에 더 큰 시각적 인 비행기의 화상 진찰을 허용하기 때문에 대중적입니다.
그러나 최근에는 어린 난자 챔버(1-8단계)가 전방 후방 축 6을 중심으로 회전하고 이 조직 운동이 이 젊은 달걀 챔버의 원주 표면에 가까운 미세한 actomyosin 네트워크에 의해 구동되는 것으로 나타났습니다. 12. 따라서,이 조직의 미묘한 평탄화로 인한 세포 표면의 인공 적인 변화는 힘 생성 actomyosin 기계의 행동에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 카운터포인트는 난자 챔버 조직이 평평해지지 않으면, 계란 챔버의 원주 표면에 있는 단백질의 현미경 이미징이 획득 평면의 감소된 크기에 의해 더욱 제한된다는 것입니다.
따라서, 우리는 Prasad 등 에서 프로토콜을 결합9 셀레스트 버그의 실험실4,10 그리고 더 커버 슬립 / 유연한 담요 / 아가로즈가 개발 된 방법에 사용되지 않도록 그들을 수정. 초파리 난자 챔버는 자유롭게 배지에서 배양되며 여기에 제시된 프로토콜은 거꾸로 된 현미경 검사법만 적용합니다. 프로토콜에는 두 부분으로 구성됩니다. 첫 번째 부분은 계란 챔버 내에서 로컬 세포 규모 (최대 15 세포)에서 actomyosin 신호의 분석에 초점을 맞추고있다. 두 번째 부분에서는 계란 챔버의 자유로운 배양으로 인한 작은 획득 평면과 관련된 한계를 극복하는 데 중점을 둡니다. 이와 관련하여, 우리는 선택적으로 추출하고 원주 조직 표면의 정의 층을 전개 반 대화 형 그래픽 사용자 인터페이스와 새로운 피지 기반의 계산 방법을 개발했다. 이것은 조직 규모 (즉, >50 세포)에서 actomyosin을 분석하는 방법을 설명하는 프로토콜에 의해 뒤따른다. 고전적 z-stack 프로젝션(도 1)을 사용하여 정의된 얇은 층의 정의된 얇은 층의 선택적 추출이 용이하지 않았기 때문에,이 사용하기 쉬운 방법은 포괄적으로 이해하기 위한 중요한 전제 조건으로 작용하여 초파리 난자 챔버의 조직 규모에서 얇은 (&1 μm) 아토미오신 네트워크의 행동.
또한, 프로토콜을 용이하게 하기 위해, 우리는 형광태그가 지정된 비근육 종래의 Myosin II 동작의 예시 타임랩스 영화(TLM) 및 샘플 파일을 제공한다(보충 파일 3참조). 묘신 II는 모터 단백질이며 아토미오신 기계의 활성 수축 부위를 나타낸다. Myosin II를 이미지화하기 위해, 우리는 MRLC라는 Myosin II의 수정 된 조절 광체인을 포함하는 Drosophila 형질 전환 라인을 사용합니다 ::GFP (자세한 내용은 재료 표 참조)12,13. 세포막을 시각화하기 위해, 프로토콜은 상업적 염료를 기반으로 한다(재료 표참조). 이 프로토콜은 작은 세포내 MRLC의 분석뿐만 아니라 12:GFP 신호12뿐만 아니라 생명법으로 관찰된 것과 같은 ±300 μM 정도의 유사한 크기의 세포내 입자에도 적합합니다::GFP12,14.
이러한 두 프로토콜은 시험관 내 배양 Drosophila 난자 챔버를 사용하여 제시되지만, actomyosin 신호의 취득은 또한 배양 매체의 최적화및 가용성에 따라 다른 조직을 사용하여 수행 될 수있다 상응하는 상용 염료를 가진 형광태그된 단백질 또는, 예를 들어, 일시적인 유전자 발현 단면도를 얻기 위하여 mRNA 미세 주사. 유사하게, 원주 표면으로부터 얇은 층을 추출하기 위한 피지 계 프로토콜은 타원 및 장기 유사 조직에 보다 일반적으로 적용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
계란 챔버의 해부 및 배양에 대한 중요한 단계 및 문제 해결
너무 많은 파리가 작은 유리병에 배치되는 경우, 플라이 푸드는 먹이 애벌레와 성인 파리가 플라이 푸드에 갇혀 점점 먹이 애벌레의 광범위한 양으로 인해 2-3 일 후 진흙 투성이를 설정할 수 있습니다. 이러한 경우, 이들의 나머지 는 신선한 음식과 새로운 유리병으로 파리를 뒤집고 자신의 수를 축소. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 셀레스트 버그 실험실에서 채택 된 접근 방식을 사용하여 계란 챔버의 체외 생활 이미징에 대한 그녀의 조언을 공유 미리암 오스터 필드에 매우 감사드립니다4. 우리는 또한 세포 세분화를 가능하게 피지 스크립트에 대한 세바스찬 토시에 감사드립니다.
Materials
| Schneider Medium | Gibco | 21720-024 | [+]-Glutamine |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | [+] 10.000 Units/ml Penicillin [+] 10.000 µg/ml Streptomycin |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F135 | Heat inactivated |
| Insulin Solution Human | Sigma | I9278 | |
| 50 ml Falcon tubes | Eppendorf | sterile | |
| Millex-GV filter | Millipore | SLGV033NS | 33 mm |
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass |
| Forceps | A. Dumont & Fils | #55 | |
| CellMask Deep Red (cell membrane dye) | Invitrogen | C10046 | |
| FM4-64 (cell membrane dye) | ThermoFisher/Invitrogen | T13320 | |
| Depression dissection slide | Fisher Scientific | 12-560B | |
| Microscopic equipment | |||
| Steromicroscope | e.g. Zeiss | Stemi SV 6 | |
| Inverted confocal microscope | e.g. Zeiss/Olympus | ||
| Spinning disc microscope | e.g. Zeiss/Andor | ||
| Microscopic glass/cover glass | e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas | ||
| Cactus tool | |||
| Wironit needle holder | Hammacher | 9160020 | |
| Cactus spine | Echinocactus grusonii/barrel cactus | ||
| Drosophila stocks used in the manuscript | |||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP | For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115. | ||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat103C | For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107. |
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