El protocolo que aquí describe el análisis de la inmunofluorescencia, recuperación de biocitina y reconstrucciones de alta calidad de interneuronas de CA2 hipocampales siguiendo los registros electrofisiológicos intracelulares in vitro, permitiendo neuronal caracterización y finalmente fina anatomía neuronal para ser estudiado.
Cómo los procesos de actividad cortical en la red información es de importancia para un gran número de cuestiones científicas básicas y clínicas. El protocolo descrito aquí identifica los bloques de edificio básicos de este circuito. Los estudios detallados de regiones corticales en última instancia proporcionará otros científicos con los componentes del circuito necesario para comprender cómo el cerebro adquiere, procesa y almacena la información y lo que sucede en la enfermedad, mientras que los electrofisiológicos y datos morfológicos son ampliamente utilizados por los neurocientíficos computacionales en la construcción de redes de modelo que explore el procesamiento de la información. El protocolo descrito aquí describe células llenas de biocitina registradas en la región CA2 del hipocampo se recuperó y luego reconstruidas en 3D. Además, el protocolo describe la demostración de la proteína de unión a calcio o péptido contenido en interneuronas grabados.
La corteza y el hipocampo son estructuras de una complejidad que la clasificación de neuronal subtipos1,2,3,4, mapas de las conexiones entre ellos5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 y cómo este circuito admite funciones cognitivas12,13,14,15 están aún bajo estudio intenso y el tema de continuo debate. Por ejemplo, para entender los detalles y la complejidad de los circuitos y para coordinar los datos obtenidos de muchos estudios diferentes, es muy útil poder definir y describir los componentes, pero sigue siendo un tema de debate cómo muchos diferentes clases de neuronas existentes, o incluso si es posible definir todas las neuronas como pertenecientes a una clase específica. Herramientas computacionales que pueden construir y probar circuitos con diferentes grados de complejidad están siendo desarrollados16,17,18, pero estos esfuerzos es la necesidad de estudios detallados de los tipos de células y de las propiedades de las conexiones entre ellos. Una gran cantidad de información sobre el circuito local del neocortex de ratas adultas ya se han recolectado usando el protocolo descrito aquí10,19,20,21, 22. aunque el “esquema” está lejos de ser completa, algunos claros patrones o reglas han surgido. Por otra parte, aunque algunos detalles varían, estas reglas son comunes a dos especies de mamíferos (ratas y gatos) y a través de varias regiones neocorticales, permitiendo el desarrollo de bloques básicos que pueden aplicarse igualmente a neocortex humano. La técnica descrita aquí se utiliza para ampliar nuestra comprensión del mapa funcional de los circuitos corticales mediante la identificación de las neuronas presinápticas y postsinápticas en las conexiones en las regiones que no han sido estudiadas en detalle antes, utilizando un protocolo que permite la preservación de tejidos excelente y notable recuperación tinción en tejido fino del cerebro adulto. Se han recabado datos sobre el circuito local de CA2 y propiedades neuronales en este subcampo con este método combinando grabaciones electrofisiológicas intracelulares (grabaciones emparejadas con microelectrodos sharp) con biocitina relleno, inmunofluorescencia, procedimientos histológicos y altamente detalladas reconstrucciones neuronales, lo que permite la comparación directa con los vecinos CA regiones23,24,25.
La técnica descrita en este artículo se ha desarrollado sobre los años para obtener detallada anatomía neuronal que permite la clasificación correcta de las células y la alta calidad y reconstrucciones exactas de ambos sus cenadores dendríticas y axonales, datos que pueden ser correlacionados con los datos electrofisiológicos de pares grabaciones utilizando electrodos afilados. El protocolo histológico ha sido optimizado para preservar la ultraestructura de las neuronas y excelente recuperación de dendríticas (incluyendo espinas) y cenadores del axonales. Por ejemplo, el principio de la técnica de doble fijación por inmersión en una solución fijadora en primer lugar y en segundo lugar la fijación en tetraóxido de osmio da un buen contraste para microscopia ligera26. Una pequeña cantidad de ácido pícrico solución de glutaraldehído y se agregan a la solución de fijación para mejorar la penetración de anticuerpos y para preservar la ultraestructura de las células como se sugiere en un anterior estudio27. La permeabilización de las rebanadas de cerebro utilizando el método de congelación y descongelación combinado con cryo-protección con sacarosa, más que un detergente tradicional, también ofrece una óptima preservación de los tejidos para análisis morfológico de las células registradas. Además, se mejora la visualización particular de estructuras finas muy reduciendo la tinción de fondo con las incubaciones con peróxido de hidrógeno (H2O2) y borohidruro de sodio (NaBH4). Adición de cloruro de níquel (NiCl2) a la peroxidasa de rábano (HRP) reacción para obtener un producto de reacción de pigmento negro también aumenta el contraste.
El siguiente protocolo describe los procedimientos utilizados para determinar la preservación de tejidos excelente y altamente detalladas reconstrucciones 3D neuronales tras grabaciones intracelulares en vitro. La descripción de la preparación de la rebanada, grabaciones pareadas intracelulares utilizando con electrodos y posteriores procedimientos histológicos utilizados en nuestro laboratorio han sido previamente divulgados28. Aunque el protocolo se aplica a las células llenadas intracelularmente con biocitina en rebanadas gruesas de 450 – 500 μm, el mismo protocolo puede utilizarse después de grabaciones de celulares. Sin embargo, el uso de cortes más delgados resultará en reconstrucciones menos completas de las células.
Las grabaciones electrofisiológicas en vitro (figura 1 CA,d y A.c., d) combinada con histoquímica y procedimientos de inmunohistoquímica permiten la morfología detallada, el contenido de proteína de unión de calcio y identidad de interneuronas corticales adultos registrados para ser revelado. En la región CA2, esta técnica permite el estudio de los circuitos locales por primera vez y reveló las subclases de interneuronas que no habían sido descritos previamente en CA1 o CA3: células de cesta de eje ancho dendrítica y axonal (figura 1B), las células bistratified y interneurons SR SP.
El protocolo descrito aquí ha sido optimizado para preservar la ultraestructura de las neuronas y excelente recuperación de dendríticas (incluyendo espinas) y cenadores del axonales. Pasos críticos incluyen el uso de la técnica de doble fijación para mejorar contraste para microscopia ligera26 y la adición de solución de glutaraldehído y ácido pícrico para la solución de fijación para mejorar la penetración del anticuerpo y preservar la neuronal ultraestructura de27. Permeabilización de hielo-deshielo apacibles da mejor preservación de estructura fina, mientras que la incrustación de resina y osmication reducen la contracción del plano z28. Además, se mejora la visualización de muy fino (finos axones con pequeños botones por ejemplo) por incubación de las secciones con H2O2 y NaBH4 para reducir la tinción de fondo. Contraste puede también incrementarse con la adición de NiCl2 a la reacción de HRP.
El procedimiento histológico detallado aquí ofrece excelentes resultados en términos de reproducibilidad y confiabilidad. Sin embargo, la duración de las grabaciones electrofisiológicas determinará la calidad de la biocitina/fluorescencia coloración, con grabaciones más cortas generalmente asociadas con pobre tinción axonal. También puede influir en la opción de registro de protocolos (grabaciones intracelulares utilizando electrodos afilados vs celulares parche de sujeción) biocitina retención y preservación de la anatomía fina.
Mientras que las dificultades en preservar estructura fina durante el procesamiento histológico se describen aquí y el tiempo necesario para reconstruir en un aumento de 100 X (1-4 semanas dependiendo de la complejidad del axón) se aprecia, este método da una representación precisa del diámetro axonal y dendrítica. El uso de menos exigentes protocolos para revelar etiquetado biocitina es comprensible, sin embargo, estos a menudo impiden una visualización clara de finas ramas axonales. Detergentes, para promover la entrada de avidina-HRP para revelar la biocitina y anticuerpos, suelen ser necesarias en secciones gruesas, pero pueden perturbar la estructura fina. Neurocientíficos buscar constantemente métodos semiautomáticos de la reconstrucción, pero, por ahora y para axones especialmente, biocitina-HRP con reconstrucción manual sigue siendo el estándar de oro31.
Altamente detallada reconstrucción neuronal, especialmente precisos dibujos de boutons axonales y nodos, la presencia o ausencia de mielina y en general el dibujo de arbor axonal completa, con la representación de diámetro de axón exacta cambia a lo largo de su longitud, proporcionar información para la identificación precisa de un tipo distinto de interneurone adicional. Aunque muchos interneurons no se ajusten exactamente a una clase específica, la técnica descrita anteriormente proporciona datos correlacionados en propiedades electrofisiológicas neuronales, la plasticidad a corto plazo asociados con un tipo específico de conexión y detallada reconstrucciones neuronales, que permite el esquema, en la región CA2, por ejemplo, para estudiar en detalle.
Fina y detallada de la estructura se simplifica a menudo en modelos computacionales. Aunque comprensible, esto resulta en la pérdida de la información que podría resultar crítico en el futuro. Análisis de reconstrucciones 3D detalladas con datos sinápticas en paralelo permite la adición de más criterios de clasificación interneuronal. Datos pueden ser depositados en repositorios públicos y utilizados por modelistas para explorar el resultado de los cambios esporádicos en diámetro del axón y myelination en potencial de acción propagación de cómputo.
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación ha recibido financiación de Novartis Pharma (Basilea) y el Consejo de investigación médica otorgado a Prof Alex Thomson, la biotecnología y de biológico Ciencias Research Council (BBSRC-BB/G008639/1), la Physiological Society, la Unión Europea Horizonte 2020 programa marco de investigación e innovación bajo el acuerdo de subvención específica núm. 720270 (cerebro humano proyecto SGA1) y bajo el acuerdo de subvención específica núm. 785907 (cerebro humano proyecto SGA2). Estamos muy agradecidos a Prof Alex Thomson para configurar el protocolo en otras regiones corticales, asegurar fondos y por su continuo apoyo para este proyecto. Se agradece aportes de miembros del laboratorio que ayudaron a optimizar el protocolo de recuperación y reconstrucción las neuronas CA2: Deuchars J. H. Pawelzik, D. I. Hughes, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.
Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
Gelatin | Sigma | 48723 | |
Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
Equipment used | |||
Vibratome | Agar Scientific | ||
C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
0.18mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
0.25mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
Glass vials 14 mL | Fisher scientific |