एसिड थकावट विधि का उपयोग करते हुए पूरे गुर्दे में नेफ्रॉन संख्या का आकलन
Summary
पूरे गुर्दे नेफ्रॉन संख्या का अनुमान नैदानिक और प्रायोगिक रूप से महत्वपूर्ण हैं, के रूप में वहां नेफ्रॉन संख्या और गुर्दे और हृदय रोग के एक बढ़ाया जोखिम के बीच एक व्युत्क्रम संघ है । इस के साथ साथ, एसिड थकावट विधि का उपयोग करें, जो पूरे गुर्दे नेफ्रॉन संख्या के तेजी से और विश्वसनीय अनुमान प्रदान करता है, का प्रदर्शन किया है ।
Abstract
नेफ्रॉन एंडोमेंट का अर्थ होता है, एक व्यक्ति के साथ पैदा होने वाले नैफ्रन की कुल संख्या, क्योंकि मनुष्यों में वृक्कजनन गर्भकाल के ३६ सप्ताह तक पूरा हो जाता है और जन्म के बाद कोई नया नेफ्रन बनता है । वृक्कक संख्या का अर्थ होता है-जन्म के बाद किसी भी बिंदु पर मापा जाने वाला नेफ्रन की कुल संख्या । आनुवंशिक और पर्यावरणीय दोनों ही कारक नेफ्रॉन एंडोमेंट और संख्या दोनों को प्रभावित करते हैं । कैसे विशिष्ट जीन या कारकों nephrogenesis और नेफ्रॉन हानि या निधन की प्रक्रिया को प्रभावित करने के लिए कम नेफ्रॉन बंदोबस्ती या संख्या के साथ व्यक्तियों गुर्दे या हृदय रोग के विकास का एक उच्च जोखिम पर माना जाता है के रूप में महत्वपूर्ण है समझ । समझ कैसे एक व्यक्ति के जीवन भर के पाठ्यक्रम पर पर्यावरण जोखिम को प्रभावित करता है नेफ्रॉन संख्या भी भविष्य रोग जोखिम का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण होगा । इस प्रकार, पूरी तरह से गुर्दे नेफ्रॉन संख्या का आकलन करने की क्षमता जल्दी और मज़बूती से एक बुनियादी प्रयोगात्मक आवश्यकता को बेहतर बनाने के लिए तंत्र है कि योगदान करने के लिए या नेफ्रोजेनेसिस या नेफ्रॉन नुकसान को बढ़ावा देने के । यहां, हम पूरे गुर्दे नेफ्रॉन संख्या के अनुमान के लिए एसिड थकावट विधि का वर्णन दादीअन, shawayri, और bricker द्वारा वर्णित प्रक्रिया के आधार पर, मामूली संशोधनों के साथ । एसिड थकावट विधि नेफ्रॉन संख्या के तेजी से और विश्वसनीय अनुमान प्रदान करता है (के रूप में ग्लोमेरुली गिनती द्वारा मूल्यांकन) है कि उन के 5% के भीतर अधिक उंनत का उपयोग कर निर्धारित कर रहे हैं, हालांकि महंगी, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग जैसे तरीकों । इसके अलावा, एसिड थकावट विधि बड़ी संख्या में नमूनों या प्रायोगिक स्थितियों में नेफ्रॉन संख्या का आकलन करने के लिए एक उत्कृष्ट उच्च थ्रूपुट पद्धति है ।
Introduction
नेफ्रोन गुर्दे की बुनियादी संरचनात्मक और कार्यात्मक इकाई दोनों है1. संरचनात्मक रूप से, नेफ्रॉन ग्लोबलस (capillaries और podocytes) के शामिल है बोमन कैप्सूल और गुर्दे नलिका के भीतर स्थित, समीपस्थ नलिका से मिलकर, henle के पाश, और बाहर का नलिका जो इकट्ठा वाहिनी में समाप्त होने । कार्यात्मक, नेफ्रॉन की भूमिका पानी और इलेक्ट्रोलाइट्स के छानने का काम और पुनर्अवशोषण और कचरे का स्राव है । आमतौर पर, नेफ्रोजेनेसिस मनुष्यों में गर्भावधि के ३६ सप्ताह और कई प्रजातियों जैसे चूहे और चूहा2में जन्म के बाद शीघ्र ही पूरा हो जाता है । नेफ्रॉन एंडोमेंट की कुल संख्या है जो एक व्यक्ति के साथ पैदा होता है, जबकि नेफ्रॉन संख्या3जन्म के बाद किसी भी समय पर मापा nephrons की कुल संख्या है । नेफ्रॉन संख्या और ग्लोमेलर संख्या शब्द अक्सर interchangeably इस्तेमाल कर रहे हैं । क्योंकि वहां केवल एक स्तंभी प्रति नेफ्रॉन है, ग्लोमुली संख्या का आकलन नेफ्रॉन संख्या का अनुमान लगाने के लिए एक महत्वपूर्ण किराए है ।
नेफ्रॉन एंडोमेंट और नेफ्रॉन नंबर का मूल्यांकन नैदानिक हित का है क्योंकि अध्ययनों ने नेफ्रोन एंडोमेंट और कम नेफ्रॉन नंबरों के बीच एक संघ का प्रदर्शन किया है जिसमें हृदय रोग की वृद्धि हुई है4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15. शव परीक्षण में गुर्दे में निष्कर्षों के आधार पर, brenner ने कहा कि ग्रस्त व्यक्तियों से normotensive16व्यक्तियों की तुलना में nephrons की एक कम कुल संख्या के साथ प्रस्तुत किया । इस प्रकार, brenner hypothesized है कि वहां नेफ्रॉन संख्या और उच्च रक्तचाप के विकास के जोखिम के बीच एक व्युत्क्रम संबंध जीवन में बाद में है । ब्रेनर भी hypothesized है कि नेफ्रॉन संख्या में कमी के लिए nephrons है कि बने द्वारा मुआवजा दिया गया था । गुर्दे में सामान्य छानने का काम दर को बनाए रखने के लिए, अवशिष्ट nephrons अपने ग्लोबलर सतह क्षेत्र (ग्लोगुलर हाइपरट्रॉफी) में वृद्धि की भरपाई, जिससे गुर्दे समारोह पर नेफ्रॉन हानि के किसी भी प्रतिकूल प्रभाव को कम करने के लिए कार्य कर रहा है4 ,16.
जबकि अल्पावधि में सुरक्षात्मक, ग्लोबरिकल hypertrophy, लंबी अवधि में, वृद्धि हुई सोडियम और द्रव प्रतिधारण बढ़ जाती है, extracellular तरल पदार्थ की मात्रा में वृद्धि हुई है, और धमनी रक्तचाप में वृद्धि, आगे बढ़ के एक दुष्चक्र के लिए अग्रणी ग्लोगुलर केशिका दबाव, ग्लोबलर हाइपरफिल्ट्रेशन, और नेफ्रॉन स्काररिंग (स्केलेरोसिस) और चोट4,16।
नेफ्रॉन संख्या का अनुमान या गिनती प्राप्त करना कुछ प्रायोगिक लाभ प्रदान करते हैं: 1) यह नेफ्रोजेनेसिस की प्रक्रिया के बारे में जानकारी प्रदान करता है, जिसे तब भ्रूण या मातृ-भ्रूण वातावरण में विशिष्ट जीन या कारकों से जोड़ा जा सकता है, और 2) वहां हृदय रोग के साथ नेफ्रॉन संख्या का एक संघ है और, इस प्रकार, वहां संभावना है कि नेफ्रॉन संख्या का अनुमान है भविष्य हृदय जोखिम2,17,18, भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 19 , 20 , 21 , 22. मातृ-भ्रूण पर्यावरण के अलावा, कई रोगों सीधे प्रभाव नेफ्रॉन संख्या और गुर्दे समारोह, atherosclerosis सहित, मधुमेह, उच्च रक्तचाप, और यहां तक कि सामान्य उम्र बढ़ने2,9, 10,11,12,22,23। इस प्रकार, पूरे गुर्दे नेफ्रॉन संख्या का आकलन दोनों आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों है कि nephroउत्पत्ति (यानी, नेफ्रॉन एंडोमेंट) और एक व्यक्ति के जीवन के पाठ्यक्रम पर नेफ्रॉन संख्या को प्रभावित और परिणामी प्रभाव दोनों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है गुर्दे समारोह और हृदय स्वास्थ्य पर ।
वर्तमान में, नेफ्रॉन संख्या के निर्धारण और परिमाणीकरण के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं, प्रत्येक अपने फायदे और सीमाओं के साथ24,25,26,27,28 ,29,30. पूरे गुर्दे नेफ्रॉन संख्या का निर्धारण करने के लिए परिष्कृत तरीके विसारक विधि, जैसे dissector के रूप में शामिल/ अक्सर माना जाता है सोने के मानक पूरे गुर्दे नेफ्रॉन संख्या का निर्धारण करने के लिए, dissector/ हाल के अग्रिमों और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग और प्रसंस्करण में सुधार के लिए प्रत्येक और हर नेफ्रॉन व्यक्तिगत गिनती करने के लिए उपकरण प्रदान की है । हालांकि, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग न केवल समय लेने वाली है, लेकिन यह भी बहुत महंगा है । इसके अलावा, दोनों dissector/प्रभाजक विधि और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग उंनत तकनीकी विशेषज्ञता की आवश्यकता है, इस प्रकार अनुसंधान प्रयोगशालाओं के बहुमत में इस तरह के तरीकों का उपयोग सीमित ।
नेफ्रॉन संख्या निर्धारित करने के अधिकांश तरीके ग्लोगुरौली की पहचान के आधार पर मायने या अनुमान बनाते हैं, क्योंकि ये आसानी से पहचाने जाने योग्य संरचनात्मक होते हैं । इस कागज में, पूरे गुर्दे में नेफ्रॉन संख्या का अनुमान लगाने के लिए एसिड थकावट विधि वर्णित है और27का प्रदर्शन किया । एसिड थकावट विधि तेजी से, विश्वसनीय है, और काफी कम अंय तरीकों से, ऐसे dissector के रूप में/ इसके अलावा, एसिड थकावट विधि नेफ्रॉन संख्या है कि चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग26का उपयोग कर निर्धारित उन की सीमा के भीतर होने की सूचना दी है की अत्यधिक repeatable अनुमान प्रदान करता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
अच्छी प्रयोगात्मक तकनीक के साथ, एसिड थकावट विधि पूरे गुर्दे में नेफ्रॉन संख्या का आकलन करने के लिए आदर्श है । हालांकि गुर्दे एसिड में भंग हो जाता है, ग्लोमरूली काफी हद तक बरकरार रहती है और आसानी से पहचा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम स्वास्थ्य, राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े, और रक्त संस्थान (R01HL107632) के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा भाग में समर्थित किया गया था ।
Materials
| Isoflurane anesthesia | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane vaporizor system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Leica Inverted Microscope DMIL LED | Leica Microsystems | DMIL LED | Any make also suitable |
| Digital water bath | Fisher Scientific | 2239 | Any make also suitable |
| ToughCut Fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | 25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight |
| Micro dissecting forceps 4 1/4 in. | Biomed Res Instruments, Inc | 10-1760 | Curved tip |
| Plexiglass board 5 in. x 7 in. | any source suitable | n/a | Any make also suitable |
| Hexagonal polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | 02-2002-100 | Any make also suitable |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Single edge carbon steel 0.009 |
| Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply | Fisher Scientific | MSD-1400250 | |
| 10x concentrate phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-4L | Dilute to 1x |
| 6 N Hydrocholric acid solution | Sigma Aldrich | 3750-32 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | Any make also suitable |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | Any make also suitable |
| Disposable 5 mL syringe | Cole Palmer | EW-07944-06 | Any make also suitable |
| 18G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Any make also suitable |
| 21G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | Any make also suitable |
| 12-well multiple-well cell culture plates with lid | Cole Palmer | #FW-01959-06 | Any make also suitable |
| Polypropylene modular test tube rack | Cole Palmer | #EW-06733-00 | Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable |
References
- Hall, J. E., Guyton, A. C. . Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology. , (2016).
- Wang, X., Garrett, M. R. Nephron number, hypertension, and CKD: physiological and genetic insight from humans and animal models. Physiological Genomics. 49 (3), 180-192 (2017).
- Didion, S. P. A novel genetic model to explore the Brenner hypothesis: Linking nephron endowment and number with hypertension. Medical Hypotheses. 106, 6-9 (2017).
- Brenner, B. M. Nephron adaptation to renal injury or ablation. American Journal of Physiology. 249 (3 Pt 2), F324-F337 (1985).
- Didion, S. P., Wang, X., Garrett, M. R. Direct correlation between blood pressure and nephron endowment in a genetic model of hypertension. Hypertension. 68, A052 (2016).
- Luyckx, V. A., Brenner, B. M. The clinical importance of nephron mass. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (6), 898-910 (2010).
- Mackenzie, H. S., Brenner, B. M. Fewer nephrons at birth: a missing link in the etiology of essential hypertension?. American Journal of Kidney Diseases. 26 (1), 91-98 (1995).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. Structural and functional changes with the aging kidney. Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).
- Denic, A., et al. The substantial loss of nephrons in healthy human kidneys with aging. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 313-320 (2016).
- Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 101-108 (2003).
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Hoy, W. E., et al. Distribution of volumes of individual glomeruli in kidneys at autopsy: association with age, nephron number, birth weight and body mass index. Clinical Nephrology. 74 (Suppl 1), S105-S122 (2010).
- Hughson, M. D., et al. Hypertension, glomerular hypertrophy and nephrosclerosis: the effect of race. Nephrology Dialysis Transplantation. 29 (7), 1399-1409 (2014).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2010).
- Brenner, B. M., Garcia, D. L., Anderson, S. Glomeruli and blood pressure. Less of one, more of the other?. American Journal of Hypertension. 1 (4 Pt 1), 335-347 (1988).
- Clark, A. T., Bertram, J. F. Molecular regulation of nephron endowment. American Journal of Physiology. 276 (4 Pt 2), F485-F497 (1999).
- Benz, K., et al. Early glomerular alterations in genetically determined low nephron number. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (2), F521-F530 (2011).
- Zhao, H., et al. Role of fibroblast growth factor receptors 1 and 2 in the ureteric bud. 발생학. 276 (2), 403-415 (2004).
- Sims-Lucas, S., Caruana, G., Dowling, J., Kett, M. M., Bertram, J. F. Augmented and accelerated nephrogenesis in TGF-beta2 heterozygous mutant mice. Pediatric Research. 63 (6), 607-612 (2008).
- Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
- Stelloh, C., et al. Prematurity in mice leads to reduction in nephron number, hypertension and proteinuria. Translational Research. 159 (2), 80-89 (2012).
- Galinsky, R., et al. Effect of intra-amniotic lipopolysaccharide on nephron number in preterm fetal sheep. American Journal of Physiology Renal Physiology. 301 (2), F280-F285 (2011).
- Bertam, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29 (4), 575-580 (2014).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Damadian, R. V., Shawayri, E., Bricker, N. S. On the existence of non-urine forming nephrons in the diseased kidney of the dog. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 65, 26-39 (1965).
- Bonvalet, J. P., et al. Number of glomeruli in normal and hypertrophied kidneys of mice and guinea-pigs. The Journal of Physiology. 269 (3), 627-641 (1977).
- Bains, R. K., Sibbons, P. D., Murray, R. D., Howard, C. V., Van Velzen, D. Stereological estimation of the absolute number of glomeruli in the kidneys of lambs. Research in Veterinary Science. 60 (2), 122-125 (1996).
- Assmann, K. J., van Son, J. P., Koene, R. A. Improved method for the isolation of mouse glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 2 (4), 944-946 (1991).
- Wang, X., et al. Nephron deficiency and predisposition to renal injury in a novel one-kidney genetic model. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1634-1646 (2015).
- Lodrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Fassi, A., et al. Progressive glomerular injury in the MWF rat is predicted by inborn nephron deficit. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (8), 1399-1406 (1998).
- Wintour, E. M., et al. Reduced nephron number in adult sheep, hypertensive as a result of prenatal glucocorticoid treatment. The Journal of Physiology. 549 (Pt 3), 929-935 (2003).
- Van Vuuren, S. H., et al. Compensatory growth of congenital solitary kidneys in pigs reflects increased nephron numbers rather than hypertrophy. PLoS One. 7 (11), e49735 (2012).
