قياس التغيرات في معدلات التمثيل الغذائي أمرا أساسيا لفهم تطور مختلف الأمراض والشيخوخة. نقدم هنا، تقنية جديدة لقياس استهلاك الأوكسجين الرأس كله أوثق تشبه الحالة الفسيولوجية ويمكن أن تساعد في الكشف عن أدوية جديدة تعديل النشاط المتقدرية.
ينظم النشاط الأيضي ضروري للسير العادي للخلايا الحية. في الواقع، غيرت النشاط الأيضي يرتبط ارتباطاً سببياً مع تطور السرطان والسكري، ونيوروديجينيريشن، والشيخوخة سبيل المثال لا الحصر. على سبيل المثال، تتسم التغيرات في النشاط الميتوكوندريا، وقوة الأيضية للخلية، في كثير من هذه الأمراض. عموما، تعتبر معدلات استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا قراءات موثوق بها من النشاط mitochondrial والقياسات في بعض هذه الدراسات تستند إلى الميتوكوندريا المعزولة أو الخلايا. بيد هذه الشروط قد لا تمثل الطابع المعقد للأنسجة كاملة. في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير أسلوب رواية التي تمكن من قياس دينامية لمعدلات استهلاك الأوكسجين من رؤساء يطير معزولة كلياً. باستخدام هذا الأسلوب، سجلنا أدنى معدلات استهلاك الأوكسجين الجزء الرأس كله في الشباب مقابل عمر الذباب. ثانيا، لقد اكتشفنا أن مثبطات deacetylase يسين تغيير سرعة استهلاك الأكسجين في الرأس كله. ولذلك قد تساعد لدينا تقنية مبتكرة في الكشف عن خصائص جديدة من المخدرات المختلفة، مما قد يؤثر على معدلات التمثيل الغذائي. وعلاوة على ذلك، قد تعطي طريقة لدينا فهم أفضل للسلوك الأيضي في إعداد تجريبية التي تشبه أكثر الدول الفسيولوجية.
ينظم النشاط الأيضي ضروري لبقاء الخلايا ووظيفة صحية للأنسجة. لقد ثبت النشاط الأيضي الضوابط على نطاق واسع أن تكون مرتبطة بظهور وتطور مختلف العلل1. على سبيل المثال، انخفاض النشاط الأيضي وصفت سابقا في أمراض الأعصاب مثل الزهايمر وضعف الذاكرة المرتبط بالعمر2،3. وعلاوة على ذلك، يعتقد خلل mitochondrial أن تشارك سببياً في4،5عملية الشيخوخة. من ناحية أخرى، وصفت أعلى معدلات mitochondrial والايض في سرطان خلايا6، حيث انخفض استخدام مثبطات الميتوكوندريا توموريجينيسيس7.
قراءات واحدة من النشاط الأيضي هو معدل استهلاك الأوكسجين (OCR) الميتوكوندريا. من المثير للاهتمام، أساسا هو الحصول على هذا النوع من قراءات من الميتوكوندريا المعزولة أو الخلايا، وبالتالي معظم ما يرد في الأدب يعتمد أساسا على قراءات التي لا تشبه الحالة الفسيولوجية. ومع ذلك، هناك عدة عيوب لهذا الأسلوب. أولاً، بروتوكول العزلة المتقدرية يحتمل أن يمكن أن تلحق الضرر سلامة8، الذي قد يكون الحرفية ذات صلة عند مقارنة الميتوكوندريا المعزولة من الشباب مقابل الأنسجة القديمة9. وعلاوة على ذلك، عملية عزل طويلة وقد يؤدي فقدان التعديلات بوستترانسلاشونال البروتين ذات الصلة التي تنظم الوظيفة المتقدرية9،،من1011. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت أن الميتوكوندريا معزولة لا تمثل دائماً الأنسجة كلها معدلات التمثيل الغذائي12،13. ويمكن اعتبار مثل هذا التعقيد البيولوجية الخلوية، ‘الجامع أكبر من مجموع أجزائه’، أي الميتوكوندريا قد عرض معدلات ايضية مختلفة داخل خلية معقدة بالمقارنة مع معدل الأيض عند معزولة.
في حين قد عرض الخلايا قراءات التعرف الضوئي على الحروف أفضل من الميتوكوندريا المعزولة، قد تضيع خلية إلى خلية الاتصال في السياق من الأنسجة كاملة. على سبيل المثال، النشاط الأيضي للخلايا العصبية في الدماغ، وتعتمد اعتماداً كبيرا على النشاط الأيضي ل الخلايا الدبقية المجاورة14. على هذا النحو، قد وضع تقنيات جديدة للتحقيق التعرف الضوئي على الحروف في الأنسجة كاملة أو الكائنات الحية كلها تثبت أكثر الثاقبة لظهور وتطور مختلف الاضطرابات.
في الآونة الأخيرة، ظهرت تقنيات جديدة معالجة هذه القضايا، وتمكين قياس التعرف الضوئي على الحروف من الأنسجة كاملة أو الجزء المتعلق بالكائنات الحية. على سبيل المثال، ذكرت عمل الأخيرة بقياس الأوكسجين من العضلات رحلة خنفساء باستخدام نهج ألياف بيرميبيليزيد مع ريسبيروميتير15. آلات جديدة للدقيقة-ريسبيروميتري تسمح بقياس التعرف الضوئي على الحروف من جزيرات البنكرياس16،17. ونتيجة لذلك، أفيد أن هذه التكنولوجيا يمكن قياس التعرف الضوئي على الحروف من كل الديدان18 وسمك الزرد19. ومع ذلك، وجود حاجز الجهاز الهضمي قد يشكل تحديا لاختبار المخدرات المختلفة في سياق التعديلات التعرف الضوئي على الحروف. من المثير للاهتمام، أظهرت التقارير الأخيرة من نيفيل والزملاء تقنية جديدة لقياس الدماغ يرقة المورفولوجية واحد مع لوحة جيدا20،21.
في هذه الدراسة، وقد استخدمنا إعداد مماثلة لتمكين قياس كامل التعرف الضوئي على الحروف من أسرة معيشية وغير النقالة المورفولوجية22. ويوفر هذا الأسلوب أيضا ميزة ثانوية في قياس أثر المخدرات المختلفة على النشاط الأيضي في شريحة كاملة، دون الحاجة إلى المرور عبر الحاجز الهضمي13،22. على سبيل المثال، أنه اتضح سابقا أن المباشرة حقن المانع deacetylase يسين (قدسي)، يعتقد أن دواء لتغيير إليه جينية في الدماغ، أدى تشكيل ذكريات تحسين23. ومع ذلك، باستخدام تقنية الرواية لدينا، اكتشفنا أن تثبيط كدك أدى إلى زيادة سريعة للتعرف الضوئي على الحروف، التي قد تكون عاملاً مساهما بنفسها في نشاط الخلايا العصبية. لدينا بروتوكول يوفر طريقة بسيطة ومبتكرة لتقييم تأثير مختلف العقاقير، والتلاعب بالجينات، أو الدول الفسيولوجية (المرض والشيخوخة) على التعرف الضوئي على الحروف في سياق الرأس كله.
لدينا أسلوب جديد يقدم نهجاً جديداً لدراسة التغيرات الاستقلابية في الشيخوخة والمرض في إطار قطاعات الرأس كله يطير22. أيضا يمكن أن تكون مناسبة الأسلوب دراسة أثر butyrate الصوديوم كدك على استهلاك الأوكسجين. وكما أظهرنا، يسين دياسيتلياسي مثبطات (هداكس/كداكس) يسفر عن تغييرات التعرف الضوئي على الحروف. أساسا، كما عادة لا يتم ترجمة أهداف هذه الموانع في الميتوكوندريا (لا تؤثر هذه مثبطات ديسيتيلاسيس “الدرجة الثالثة”، سيرتوينس)24، يمكن أن يكون اختبار هذه العقاقير فقط على على الأقل مستوى الأنسجة. وفي الواقع، يتم حقن المخدرات المختلفة مباشرة إلى الدماغ، وبالتالي تجاوز الممكن تجهيز/تعديل/المنظمة بالجهاز الهضمي. على هذا النحو، يقدم لنا تقنية الرواية نظرة ثاقبة كيف تلك العقاقير مباشرة أثر الجزء الرئيسي.
وهناك العديد من الخطوات الحاسمة. أولاً، وكما ورد في البروتوكول، نوصي بشدة إعداد لوحة تحت ساعة واحدة، مع اثنين من أزواج من أيدي إعداد اللوحة. من خلال تجربتنا، على جودة واستقرار القياسات التعرف الضوئي على الحروف أفضل عند إعدادها في الوقت مناسب. عندما تأخذ وقتاً طويلاً، هو تزايد حدوث انخفاض الآبار المستهلكة التعرف الضوئي على الحروف، فضلا عن تقصير مدة مستقرة التعرف الضوئي على الحروف. وثانيا، من المهم إجراء فحص جودة وضمان ظروف تجريبية بين العينات المختلفة مماثلة (درجة الحموضة، مستويات الأوكسجين). وأخيراً، خطوة حاسمة في اختيار الخوارزمية الصحيح لتحليل العينات. وكما أظهرنا، الخوارزمية الافتراضية أكوس أسفرت عن عملية حسابية مضللة وأحيانا متعارضة في العينات التي تستهلك الأوكسجين في ارتفاع معدلات13. ولذلك نؤكد على أهمية التحقق من البيانات الخام لمستويات الأوكسجين ومقارنة OCR الناتجة عن ذلك.
حاليا، هناك العديد من القيود مع هذا الأسلوب. في درجة حرارة الغرفة، الجهاز مع ارتفاع درجات الحرارة تصل إلى 31 درجة مئوية (هذا هو قياس درجة الحرارة الدنيا في حين أن الجهاز في درجة حرارة الغرفة)، والتي قد تمثل حالة إجهاد ل يطير رؤساء25. وهذا يمكن التغلب عليها إلا عن طريق وضع الإله في غرفة باردة، مما سيمكن القياسات عند 25 درجة مئوية ومن ثم دون إجهاد حرارة ممكنة إلى الرؤساء يطير. أظهر تقرير صدر مؤخرا وضع الجهاز في 11 درجة مئوية، وبالتالي تمكين تسجيل التعرف الضوئي على الحروف من الذباب في21من 25 درجة مئوية. ومع ذلك، ينبغي القيام بفصل رأسه يطير في درجة حرارة الغرفة. وعلاوة على ذلك، تقلبات درجة الحرارة تجعل من التحدي لمراقبة التغييرات الأس الهيدروجيني ولذلك ينصح باختبار أثر الظروف الفسيولوجية/المخدرات في التعرف الضوئي على الحروف باستخدام الأجهزة تجريبية مماثلة. وبالإضافة إلى ذلك، لم يكن مساهمة استهلاك الأوكسجين بالآليات غير-الميتوكوندريا-مستقلة بعد المنشأة26. باستخدام مختلف مثبطات الجهاز التنفسي التي تتسم بالكفاءة في رؤساء يطير، سيكون من الممكن وضع معدلات استهلاك الأوكسجين غير المتقدرية هذه.
جدير بالذكر أن مختلف العلل الثدييات تتميز بالتعديلات في استقلاب الطاقة. فيما بينها، هي الأمراض التي تتميز بها أما خفض التمثيل الغذائي مثل مرض الزهايمر أو الأيضية الأسلاك مثل السرطان. من المثير للاهتمام، ومثبطات كدك تستخدم ل علاج مرض الزهايمر والسرطان27. بينما آليات دقيقة من كدك التي مثبطات هي تحقيق الجانب العلاجي لا تزال غير واضحة، يدعم البيانات من تقنية لدينا فكرة الرواية أن هذه الموانع قد تعدل الأيض.
باختصار، هذا الأسلوب قيمة لقياس استهلاك الأوكسجين عموما معدلات في فيفو وأكثر دقة عرض تأثيرات المخدرات على التمثيل الغذائي العام، التي قد أغفلت في الميتوكوندريا المعزولة البروتوكولات12. على سبيل المثال، النتائج التي تم الحصول عليها من هذا الأسلوب، بدلاً من الأساليب السابقة، تورطت رؤى الرواية لعدم المرونة الأيضية المرتبطة بالعمر عند معاملة كدك. بينما عمل إضافي ضروري لتحسين ظروف تجريبية ليطير رؤساء، الجمع بين تقنية وتحليل مناسب قد يؤدي إلى المزيد من الإيضاح النشاط المتقدرية في سياق الأنسجة الحية كلها.
The authors have nothing to disclose.
ونحن نشكر Ladurner أندرياس، كارلا مارجوليس وفرقهم لدعم تجريبية واسعة النطاق. ونشكر أوندراسيك كيتلين لتعليقاتها على المخطوطة. نود أن نشكر فيكستروم صوفيا لمساعدتنا في تحديد المراحل الأولى لهذه التقنية. ونشكر أيضا “قد سانديرهوف” للها المساعدة التقنية. وتمول رطل الوزارة الألمانية الاتحادية للتعليم والبحوث (منحة إينفرافرونتير 01KX1012). س مولت زمالة “أكسا صندوق أبحاث” ما بعد الدكتوراه وتشرف (رقم المنحة 81870900). وتمول AVV قبم.
Glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered |
XF assay Medium | Agilent | 103575-100 | Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4 |
Sodium butyrate | Merck | 817500 | Dissolved in XF assay buffer |
Seahorse XF24/e24 analyzer | Agilent | ||
XF24/e24 Extracellular Assay Kit | Agilent | 100850-001 | Cartridge |
XF24/e24 Islet Capture Microplates | Agilent | 101122-100 | Plate |
Seahorse Capture Screen Insert Tool | Agilent | 101135-10 | Insertor |
Petri dish | Sarstedt | 821,472 | Petri dish 92 x 16 mm |