चयापचय दरों में परिवर्तन को मापने विभिंन रोगों और उंर बढ़ने की प्रगति को समझने के लिए केंद्रीय है । यहां, हम पूरे सिर ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए एक उपंयास तकनीक मौजूद है कि अधिक निकटता शारीरिक राज्य जैसा दिखता है और उपंयास दवाओं है कि mitochondrial गतिविधि को संशोधित खुलासा में सहायता कर सकते हैं ।
विनियमित चयापचय गतिविधि जीवित कोशिकाओं के सामान्य कामकाज के लिए आवश्यक है. वास्तव में, बदल चयापचय गतिविधि कारण कैंसर, मधुमेह, neurodegeneration की प्रगति के साथ जुड़ा हुआ है, और कुछ नाम उंर बढ़ने । उदाहरण के लिए, mitochondrial गतिविधि में परिवर्तन, कोशिका की चयापचय बिजलीघर, कई ऐसे रोगों में विशेषता है । आम तौर पर, mitochondria की ऑक्सीजन खपत की दरों में mitochondrial गतिविधि और माप का एक विश्वसनीय readout माना जाता था इनमें से कुछ अध्ययनों में पृथक mitochondria या कोशिकाओं पर आधारित थे. हालांकि, इस तरह की स्थितियों एक पूरे ऊतक की जटिलता का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं । हाल ही में, हम एक उपंयास तरीका है कि पूरी अलग मक्खी सिर से ऑक्सीजन की खपत दर के गतिशील माप में सक्षम बनाता है विकसित की है । इस विधि का उपयोग करके, हम वृद्ध मक्खियों बनाम युवा में पूरे सिर खंड के कम ऑक्सीजन खपत दर दर्ज की गई है । दूसरे, हमें पता चला है कि lysine deacetylase अवरोधकों तेजी से पूरे सिर में ऑक्सीजन की खपत में परिवर्तन । हमारे उपंयास तकनीक इसलिए विभिंन दवाओं, जो चयापचय दर प्रभाव मई के नए गुणों को उजागर करने में सहायता कर सकते हैं । इसके अलावा, हमारी विधि एक प्रयोगात्मक सेटअप में चयापचय व्यवहार की एक बेहतर समझ है कि और अधिक निकटता शारीरिक राज्यों जैसा दिखता दे सकता है ।
विनियमित चयापचय गतिविधि कोशिकाओं और एक ऊतक के स्वस्थ समारोह के अस्तित्व के लिए आवश्यक है । विनियमित चयापचय गतिविधि को बड़े पैमाने पर शुरू किया गया है और विभिंन विकृतियों1की प्रगति से जुड़ा हुआ दिखाया गया है । उदाहरण के लिए, कम चयापचय गतिविधि पहले neurodegenerative रोगों जैसे अल्जाइमर और उम्र से जुड़े स्मृति हानि2,3में वर्णित किया गया था. इसके अलावा, mitochondrial शिथिलता के कारण उंर बढ़ने की प्रक्रिया4,5में शामिल माना जा रहा है । दूसरी ओर, उच्च mitochondrial और चयापचय दर कैंसर कोशिकाओं6, जहां mitochondrial अवरोधकों के उपयोग tumorigenesis7कम में वर्णित किया गया ।
चयापचय गतिविधि का एक readout mitochondria की ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) है । दिलचस्प है, readout के इस प्रकार के मुख्य रूप से पृथक mitochondria या कोशिकाओं से प्राप्त की है, इस प्रकार क्या साहित्य में वर्णित के बहुमत मुख्यतः एक readout है कि शारीरिक राज्य के समान नहीं है पर आधारित है । हालांकि इस तकनीक को लेकर कई कमियां हैं । सबसे पहले, mitochondrial अलगाव के प्रोटोकॉल संभवतः अपनी अखंडता8है, जो एक प्रासंगिक मूर्ति जब युवा बनाम पुराने ऊतकों9से अलग mitochondria तुलना हो सकती है नुकसान कर सकते हैं । इसके अलावा, अलगाव की प्रक्रिया लंबी है और प्रासंगिक प्रोटीन posttranslational संशोधनों जो mitochondrial समारोह9,10,11को विनियमित के नुकसान में परिणाम हो सकता है । इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि अलग mitochondria लगातार पूरे चयापचय12,13दरों का प्रतिनिधित्व नहीं करते । इस तरह के सेलुलर जैविक जटिलता के रूप में देखा जा सकता है, ‘ पूरे अपने ‘ भागों, यानी की राशि से अधिक है , mitochondria एक जटिल कोशिका के अंदर अलग चयापचय दर प्रदर्शित कर सकते हैं जब अलग उनकी चयापचय दर के साथ तुलना में.
जबकि कोशिकाओं अलग mitochondria, एक पूरे ऊतक के संदर्भ में सेल संचार के लिए सेल से readout एक बेहतर ओसीआर की पेशकश कर सकते है खो सकता है । उदाहरण के लिए, मस्तिष्क में, न्यूरॉन्स की चयापचय गतिविधि पड़ोसी glial कोशिकाओं14के चयापचय गतिविधि पर अत्यधिक निर्भर है. जैसे, पूरे ऊतक या पूरे जीवों में ओसीआर की जांच करने के लिए नई तकनीक की स्थापना और विभिन्न विकारों की शुरुआत और प्रगति के लिए और अधिक व्यावहारिक साबित हो सकता है ।
हाल ही में, नई तकनीक इन मुद्दों के समाधान और पूरे ऊतक, खंड, या रहने वाले जीवों से ओसीआर की माप को सक्षम करने के लिए उभरा है । उदाहरण के लिए, हाल ही में एक काम एक आत्मशोधन15के साथ एक permeabilized फाइबर दृष्टिकोण का उपयोग करके एक बीटल उड़ान मांसपेशी से ऑक्सीजन माप की सूचना दी । माइक्रो-respirometry के लिए नई मशीनों अग्नाशय टाप16,17के ओसीआर की माप की अनुमति दें । नतीजतन, यह सूचित किया गया है कि इस प्रौद्योगिकी पूरे कीड़े18 और ज़ेबरा मछली19से ओसीआर की माप में सक्षम बनाता है । हालांकि, पाचन बाधा की उपस्थिति ओसीआर परिवर्तन के संदर्भ में विभिन्न दवाओं के परीक्षण के लिए एक चुनौती पैदा कर सकता है । दिलचस्प है, नेविल और सहयोगियों द्वारा हाल ही में रिपोर्ट अच्छी थाली20,21के साथ एकल drosophila लार्वा मस्तिष्क को मापने के लिए एक नई तकनीक को दिखाया गया है ।
इस अध्ययन में, हम एक समान सेटअप पूरे के रहने वाले और गैर मोबाइल Drosophila22से पूरे ओसीआर के माप को सक्षम करने के लिए इस्तेमाल किया है । यह तकनीक भी एक पूरे क्षेत्र में चयापचय गतिविधि पर विभिन्न दवाओं के प्रभाव को मापने में एक द्वितीयक लाभ प्रदान करता है, पाचन तंत्र बाधा के माध्यम से पारित करने के लिए बिना13,22. उदाहरण के लिए, यह पहले lysine deacetylase अवरोध करनेवाला (KDACi), एक दवा मस्तिष्क में epigenetic तंत्र को बदलने के लिए माना जाता है कि प्रत्यक्ष इंजेक्शन का प्रदर्शन किया गया था, एक बेहतर यादों के गठन के परिणामस्वरूप23. हालांकि, हमारे उपंयास तकनीक का उपयोग करके, हमें पता चला कि KDAC अवरोध के परिणामस्वरूप ओसीआर की एक तेजी से वृद्धि हुई है, जो स्वयं के द्वारा एक योगदान कारक हो सकता है ंयूरॉन गतिविधि में । हमारे प्रोटोकॉल एक पूरे सिर के संदर्भ में ओसीआर पर विभिन्न दवाओं, आनुवंशिक हेरफेर, या शारीरिक राज्यों (रोग, उम्र बढ़ने) के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक सरल और उपंयास विधि प्रदान करता है ।
हमारी नई तकनीक एक उपंयास के लिए उंर बढ़ने और रोग में चयापचय परिवर्तन के अध्ययन के लिए पूरी मक्खी प्रमुख क्षेत्रों22के संदर्भ में दृष्टिकोण प्रदान करता है । विधि ऑक्सीजन की खपत पर KDAC सोडियम butyrate के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए भी अनुकूल हो सकता है । जैसा कि हम प्रदर्शन किया है, lysine deacetlyase अवरोधकों (HDACs/KDACs) ओसीआर परिवर्तन में परिणाम । मूलतः, इस तरह के अवरोधकों के लक्ष्य के रूप में आम तौर पर mitochondria में स्थानीयकृत नहीं कर रहे है (इन अवरोधकों वर्ग III deacetylases प्रभाव नहीं है, Sirtuins)24, ऐसी दवाओं केवल एक पर परीक्षण किया जा सकता है कम ऊतक स्तर. वास्तव में, विभिन्न दवाओं सीधे मस्तिष्क को इंजेक्ट कर रहे हैं, इस प्रकार पाचन तंत्र द्वारा संभव प्रसंस्करण/संशोधन/निष्क्रियता को दरकिनार । जैसे, हमारी तकनीक में उपंयास अंतर्दृष्टि प्रदान करता है कैसे इस तरह की दवाओं सीधे सिर खंड प्रभाव ।
इसमें कई अहम कदम उठाए गए हैं । पहले, के रूप में प्रोटोकॉल में कहा गया है, हम बहुत से एक घंटे के तहत एक थाली की तैयारी की सिफारिश हाथ के दो जोड़े के साथ थाली तैयार । हमारे अनुभव से, गुणवत्ता और ओसीआर माप की स्थिरता बेहतर है जब एक समय पर ढंग से तैयार कर रहे हैं । जब भी लंबे समय लेने, कम ओसीआर खपत कुओं की घटना बढ़ रही है, साथ ही स्थिर ओसीआर की कम अवधि. दूसरा, यह एक गुणवत्ता की जांच का संचालन और यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि विभिंन नमूनों के बीच प्रयोगात्मक शर्तों (पीएच, ऑक्सीजन का स्तर) समान हैं । अंत में, एक महत्वपूर्ण कदम सही एल्गोरिथ्म का चयन करने के लिए नमूने का विश्लेषण है । जैसा कि हम का प्रदर्शन किया है, डिफ़ॉल्ट अकोस एल्गोरिथ्म एक भ्रामक और कभी नहीं नमूनों में गणना का विरोध है कि उच्च दर13पर ऑक्सीजन की खपत उपज । इसलिए हम ऑक्सीजन के स्तर के लिए कच्चे डेटा की जांच के महत्व और परिणामस्वरूप ओसीआर तुलना तनाव ।
वर्तमान में, इस तकनीक के साथ कई सीमाएं हैं । कमरे के तापमान पर, मशीन 31 डिग्री सेल्सियस तक तपता है (यह न्यूनतम मापने तापमान है, जबकि मशीन कमरे के तापमान पर है), जो मक्खी25सिर के लिए एक तनाव राज्य का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । हालांकि यह एक ठंडे कमरे में मशीन रखकर दूर किया जा सकता है, जो 25 डिग्री सेल्सियस पर माप सक्षम हो जाएगा और इसलिए मक्खी सिर करने के लिए एक संभव गर्मी तनाव के बिना । हाल की रिपोर्ट 11 डिग्री सेल्सियस पर मशीन रखने का प्रदर्शन किया है, इस प्रकार 25 डिग्री सेल्सियस पर मक्खियों के ओसीआर रिकॉर्डिंग सक्षम करने से21। फिर भी, मक्खी सिर जुदाई कमरे के तापमान पर किया जाना चाहिए । इसके अलावा, तापमान उतार चढ़ाव यह पीएच परिवर्तन को नियंत्रित करने के लिए चुनौतीपूर्ण है और इसलिए यह अत्यधिक इसी प्रायोगिक setups का उपयोग करके ओसीआर पर शारीरिक स्थितियों/दवाओं के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए सिफारिश की है । इसके अलावा गैर mitochondrial-स्वतंत्र तंत्र द्वारा ऑक्सीजन खपत के योगदान को अभी तक२६नहीं स्थापित किया गया है. विभिन्न श्वसन अवरोधकों कि मक्खी प्रमुखों में कुशल हैं का उपयोग करके, यह इस तरह के गैर mitochondrial ऑक्सीजन खपत दर स्थापित करने के लिए संभव होगा.
यह उल्लेखनीय है कि विभिंन स्तनधारी विकृतियों ऊर्जा चयापचय में परिवर्तन की विशेषता है । उनमें रोग है कि या तो चयापचय कमी जैसे अल्जाइमर रोग या कैंसर के रूप में चयापचय तारों की विशेषता है । दिलचस्प है, KDAC अवरोधकों दोनों अल्जाइमर रोग और कैंसर के उपचार के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं27. जबकि सटीक तंत्र है जिसके द्वारा KDAC अवरोधकों चिकित्सकीय पहलू को प्राप्त कर रहे है स्पष्ट नहीं रह, हमारी तकनीक से डेटा उपंयास धारणा है कि ऐसे अवरोधकों चयापचय मिलाना का समर्थन करता है ।
संक्षेप में, इस विधि में vivo में समग्र ऑक्सीजन खपत दर को मापने के लिए मूल्यवान है और अधिक सही सामान्य चयापचय पर दवा प्रभाव प्रदर्शित करता है, जो अलग mitochondria प्रोटोकॉल12में अनदेखी की जा सकती है. उदाहरण के लिए, इस विधि से प्राप्त परिणाम, बजाय पिछले तकनीक, KDAC उपचार पर उंर के लिए उपंयास अंतर्दृष्टि जुड़े चयापचय में लचीलापन फंसाया है । जबकि अतिरिक्त काम के लिए उड़ान सिर के लिए प्रयोगात्मक शर्तों का अनुकूलन आवश्यक है, हमारी तकनीक और उपयुक्त विश्लेषण के संयोजन के पूरे रहने वाले ऊतकों के संदर्भ में mitochondrial गतिविधि के आगे elucidation के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
The authors have nothing to disclose.
हम व्यापक प्रयोगात्मक समर्थन के लिए एंड्रियास Ladurner, कार्ला Margulis और उनकी टीमों को धन्यवाद । हम पांडुलिपि पर उसकी टिप्पणी के लिए केटलीन Ondracek धंयवाद । हम इस तकनीक के प्रारंभिक चरणों की स्थापना में हमें सहायता के लिए सोफिया Vikstrom शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । हम भी उसके तकनीकी मदद के लिए Sanderhoff मई धंयवाद । पौंड जर्मन संघीय शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय (Infrafrontier अनुदान 01KX1012) द्वारा वित्त पोषित है । एसपी ने एक AXA रिसर्च फंड postdoctoral फेलोशिप और NSFC (ग्रांट नंबर ८१८७०९००) से पैसा जुटाया था । AVV QBM द्वारा वित्त पोषित है ।
Glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered |
XF assay Medium | Agilent | 103575-100 | Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4 |
Sodium butyrate | Merck | 817500 | Dissolved in XF assay buffer |
Seahorse XF24/e24 analyzer | Agilent | ||
XF24/e24 Extracellular Assay Kit | Agilent | 100850-001 | Cartridge |
XF24/e24 Islet Capture Microplates | Agilent | 101122-100 | Plate |
Seahorse Capture Screen Insert Tool | Agilent | 101135-10 | Insertor |
Petri dish | Sarstedt | 821,472 | Petri dish 92 x 16 mm |