खाद्य और पर्यावरणीय नमूनों से साल्मोनेला का अर्ध-metagenomic विश्लेषण
Summary
यहां, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए भोजन और पर्यावरण microbiomes से डीएनए नमूने तैयार करने के लिए और quasimetagenomic अनुक्रमण के माध्यम से साल्मोनेला के के उपलेखन का पता लगाने । संस्कृति संवर्धन के संयुक्त उपयोग, immunomagnetic जुदाई (आईएमएस), और कई विस्थापन प्रवर्धन (एमडीए) भोजन और पर्यावरण के नमूनों से साल्मोनेला जीनोमिक डीएनए की प्रभावी एकाग्रता की अनुमति देता है ।
Abstract
अर्ध-metagenomics अनुक्रमण खाद्य और पर्यावरणीय नमूनों की संशोधित microbiomes के अनुक्रमण आधारित विश्लेषण करने के लिए संदर्भित करता है । इस प्रोटोकॉल में, microbiome संशोधन एक लक्ष्य के जीनोमिक डीएनए ध्यान केंद्रित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है foodborne रोगज़नक़ contaminant एक कार्यप्रवाह में रोगज़नक़ के पता लगाने और उपलेखन की सुविधा के लिए. यहां, हम समझाने और अल्फला अंकुरित, जमीन काली मिर्च, जमीन बीफ़, चिकन स्तन सहित प्रतिनिधि खाद्य और पर्यावरणीय नमूनों से साल्मोनेला enterica के अर्ध-metagenomics विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी कदम का प्रदर्शन और पर्यावरणीय झाड़ू । नमूने पहले एक छोटा और समायोज्य अवधि (4-24 एच) के लिए साल्मोनेला के संस्कृति संवर्धन के अधीन हैं । साल्मोनेला कोशिकाओं को तो चुनिंदा immunomagnetic जुदाई (आईएमएस) द्वारा संवर्धन संस्कृति से कब्जा कर रहे हैं । अंत में, एकाधिक विस्थापन प्रवर्धन (एमडीए) आईएमएस से डीएनए बढ़ाना-कोशिकाओं पर कब्जा किया है । इस प्रोटोकॉल के डीएनए उत्पादन उच्च प्रवाह अनुक्रमण प्लेटफार्मों द्वारा अनुक्रम किया जा सकता है । एक वैकल्पिक मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण साल्मोनेला का पता लगाने के लिए अनुक्रमण की जगह या अनुक्रमण से पहले साल्मोनेला डीएनए की एकाग्रता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है ।
Introduction
Metagenomics अनुक्रमण सैद्धांतिक रूप से foodborne रोगजनकों के ठोस पहचान और टाइपिंग की अनुमति देता है । हालांकि, खाद्य नमूनों खाद्य microbiome के प्रत्यक्ष अनुक्रमण द्वारा रोगज़नक़ विश्लेषण करने के लिए चुनौतियों वर्तमान । सबसे पहले, foodborne रोगजनकों अक्सर भोजन के नमूनों में निम्न स्तर पर मौजूद हैं । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तेजी से पता लगाने के अधिकांश तरीकों अभी भी 8-48 एच संवर्धन एक जासूसी स्तर1के लिए रोगज़नक़ कोशिकाओं को समृद्ध करने की आवश्यकता है । दूसरा, कई खाद्य पदार्थ प्रचुर मात्रा में माइक्रोफ्लोरा कोशिकाओं और/या भोजन डीएनए, foodborne रोगजनक डीएनए खाद्य metagenome का एक छोटा सा अंश और पता लगाने और प्रत्यक्ष metagenomic अनुक्रमण द्वारा उपलेखन के लिए एक मायावी लक्ष्य बना रहे हैं ।
खाद्य microbiomes के संशोधन के लिए पर्याप्त एकाग्रता की अनुमति दी गई है foodborne रोगज़नक़ डीएनए के अनुक्रमण आधारित पता लगाने की सुविधा के लिए शिगा विष के उत्पादन ई कोलाई2,3 और साल्मोनेला enterica4. क्योंकि संशोधित खाद्य microbiomes अभी भी अलग माइक्रोबियल प्रजातियों के मिश्रण हैं, उनके अनुक्रमण अर्ध metagenomic विश्लेषण4के रूप में किया जाता है । Microbiome संशोधन संस्कृति संवर्धन अकेले2,3 या immunomagnetic जुदाई (आईएमएस) और एकाधिक विस्थापन प्रवर्धन (एमडीए)4,5के साथ संयोजन में द्वारा किया जा सकता है । आईएमएस चुनिंदा एंटीबॉडी-लेपित चुंबकीय मोतियों के माध्यम से संवर्धन संस्कृति से रोगज़नक़ कोशिकाओं पर कब्जा कर सकते हैं । एमडीए बहुत कुशल ɸ29 डीएनए पोलीमरेज़6के माध्यम से अनुक्रमण के लिए जीनोमिक डीएनए के पर्याप्त मात्रा में उत्पन्न कर सकते हैं. आईएमएस-एमडीए ने संस्कृति-नैदानिक नमूने से स्वतंत्र रोगज़नक़ पता लगाने की अनुमति दी है7, और अर्ध के लिए संस्कृति संवर्धन का छोटा metagenomic का पता लगाने और खाद्य नमूनों में साल्मोनेला के उपलेखन4।
इस विधि का समग्र लक्ष्य साल्मोनेला जीनोमिक डीएनए और बाद में पता लगाने और अनुक्रमण द्वारा साल्मोनेला contaminant के उपलेखन के लक्षित एकाग्रता की अनुमति देने के लिए भोजन के नमूनों से अर्ध-metagenomic डीएनए तैयार करने के लिए है । साल्मोनेला डिटेक्शन के लिए मानक तरीकों की तुलना में8,9 और टंकण10, quasimetagenomic दृष्टिकोण काफी प्रदूषित भोजन और पर्यावरण के नमूनों से बदलाव समय छोटा कर सकते है एक ही कार्यप्रवाह में दो आम तौर पर अलग विश्लेषण को एकीकृत करके रोगज़नक़ के आणविक उपप्रकार । इस विधि foodborne प्रकोप प्रतिक्रिया और अन्य ट्रेस वापस जांच के रूप में अनुप्रयोगों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है जहां मजबूत रोगजनक टाइपिंग रोगज़नक़ का पता लगाने और तेजी से विश्लेषणात्मक बदलाव के अलावा आवश्यक है महत्वपूर्ण है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
क्योंकि अक्सर-कम बहुतायत और खाद्य और पर्यावरणीय नमूनों में साल्मोनेला की समरूप उपस्थिति में, संस्कृति संवर्धन से पहले आईएमएस-एमडीए अभी भी साल्मोनेला का पता लगाने और उपलेखन के लिए आवश्यक है; इस?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक कृपया इस अध्ययन के लिए बैक्टीरियल तनाव और अंय समर्थन प्रदान करने के लिए जॉर्जिया विश्वविद्यालय के मार्क हैरिसन और वेन हिर्श शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| Laboratory blender bag w/filter | VWR | 10048-886 | |
| Buffered peptone water | Oxoid Micorbiology Products | CM0509 | |
| Rappaport Vassiliadis broth | Neogen Acumedia | 7730A | |
| Polysorbate 20 | Millipore Sigma | P9416 | Tween 20 |
| Stomacher blender | Seward | 30010108 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75005194 | |
| 50ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | |
| Thermal Cycler | Techne Prime | EW-93945-13 | |
| StepOne Real-Time Thermal cycler | Applied Biosystems | 4.76357 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | PCR purification beads; mix well before use; store at 4C |
| Nextera XT library prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Store at -80C |
| MinIon library prep kit | Oxford Nanopore | SQK-LSK108 | Store at -80C |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Dynabead Anti-Salmonella beads | Applied Biosystems | 71002 | Vortex well prior to use |
| Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix |
GE Healthcare | 25-6600-30 | Store at -80C |
| HulaMixer | Invitrogen | 15920D | |
| DynaMag magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
| TaqMan Universal PCR mastermix | Applied Biosystems | 4304437 | Mix well before use; store at 4C |
| Microfuge | Fisher Scientific | 05-090-100 |
References
- Valderrama, W. B., Dudley, E. G., Doores, S., Cutter, C. N. Commercially Available Rapid Methods for Detection of Selected Food-borne Pathogens. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (9), 1519-1531 (2016).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. Application of metagenomic sequencing to food safety: detection of Shiga Toxin-producing Escherichia coli on fresh bagged spinach. Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8183-8191 (2015).
- Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. Strain-Level Discrimination of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Spinach Using Metagenomic Sequencing. PLoS One. 11 (12), e0167870 (2016).
- Hyeon, J. Y., et al. Quasi-metagenomics and realtime sequencing aided detection and subtyping of Salmonella enterica from food samples. Applied and Environmental Microbiology. , (2017).
- Hyeon, J. Y., Deng, X. Rapid detection of Salmonella in raw chicken breast using real-time PCR combined with immunomagnetic separation and whole genome amplification. Food Microbiology. 63, 111-116 (2017).
- Hosono, S., et al. Unbiased whole-genome amplification directly from clinical samples. Genome Research. 13 (5), 954-964 (2003).
- Seth-Smith, H. M., et al. Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture. Genome Research. 23 (5), 855-866 (2013).
- Jacobson, A. P., Gill, V. S., Irvin, K. A., Wang, H., Hammack, T. S. Evaluation of methods to prepare samples of leafy green vegetables for preenrichment with the Bacteriological Analytical Manual Salmonella culture method. Journal of Food Protection. 75 (2), 400-404 (2012).
- Jacobson, A. P., Hammack, T. S., Andrews, W. H. Evaluation of sample preparation methods for the isolation of Salmonella from alfalfa and mung bean seeds with the Bacteriological Analytical Manual’s Salmonella culture method. Journal of AOAC International. 91 (5), 1083-1089 (2008).
- Deng, X., et al. Comparative analysis of subtyping methods against a whole-genome-sequencing standard for Salmonella enterica serotype Enteritidis. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 212-218 (2015).
- . Microbiology Laboratory Guidebook Available from: https://www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook (2018)
- . Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5: Salmonella Available from: https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm (2018)
- Malorny, B., et al. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food. Applied and Environmental Microbiology. 70 (12), 7046-7052 (2004).
- June, G. A., Sherrod, P. S., Hammack, T. S., Amaguana, R. M., Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from raw flesh and other highly contaminated foods: precollaborative study. Journal of AOAC International. 78 (2), 375-380 (1995).
- Hammack, T. S., Amaguana, R. M., June, G. A., Sherrod, P. S., Andrews, W. H. Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella spp. from foods with a low microbial load. Journal of Food Protection. 62 (1), 16-21 (1999).
- Wood, D. E., Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology. 15 (3), R46 (2014).
- Davis, S., Pettengill, J. B., Luo, Y., Payne, J., Shpuntoff, A., Rand, H., Strain, E. CFSAN SNP Pipeline: an automated method for constructing SNP matrices from next-generation sequence data. PeerJ Computer Science. 1 (e20), (2015).
- Zhang, S., et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. Journal of Clinical Microbiology. 53 (5), 1685-1692 (2015).
- Rodrigue, S., et al. Whole genome amplification and de novo assembly of single bacterial cells. PLoS One. 4 (9), e6864 (2009).
- Ramamurthy, T., Ghosh, A., Pazhani, G. P., Shinoda, S. Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria. Front Public Health. 2, 103 (2014).
