4D Микроскопия дрожжей
Summary
Этот протокол описывает анализ флуоресцентно помеченных внутриклеточных отсеков в подающих надежды дрожжей с помощью многоцветной 4D (промежуток времени 3D) конфокальной микроскопии. Параметры изображения выбираются для захвата адекватных сигналов, ограничивая при этом фотоповреждения. Пользовательские плагины ImageJ позволяют отслеживать и количественно анализировать помеченные структуры.
Abstract
Цель юристого протокола – охарактеризовать, как формируются и трансформируются в живые клетки подающих надежды дрожжей. Многие внутриклеточные отсеки в дрожжах динамичны, и полное понимание их свойств требует замедленной визуализации. Многоцветная 4D конфокальная флуоресценционная микроскопия является мощным методом отслеживания поведения и состава внутриклеточного отсека в временной шкале 5-15 мин. Строгий анализ динамики отсека требует захвата тысяч оптических Разделы. Для достижения этой цели фотоотбеление и фототоксичность сводятся к минимуму путем быстрого сканирования при очень низкой мощности лазера, а размеры пикселей и интервалы в шагах устанавливаются на самые большие значения, совместимые с выборкой изображения при полном разрешении. Полученные 4D наборы данных шумные, но могут быть сглажены путем деконволюции. Даже при высоком качестве данных, этап анализа является сложной задачей, поскольку внутриклеточные структуры часто многочисленны, неоднородны и мобильны. Для удовлетворения этой потребности, пользовательские плагины ImageJ были написаны для массива 4D данных на экране компьютера, определить структуры, представляющие интерес, отсеивать данные, чтобы изолировать отдельные структуры, количественно флуоресценции время курсы, и делать фильмы из прогнозируемых стеков. 4D-фильмы особенно полезны для различения стабильных отсеков от переходных отсеков, которые переворачиваются при созревании. Такие фильмы также могут быть использованы для характеристики таких событий, как слияние отсеков, и для проверки влияния конкретных мутаций или других возмущений.
Introduction
Сравнения эндомембранной системы находятся в постоянном движении, и их полная характеристика требует визуализации живых клеток. Описано здесь протокол, который использует 4D (замедленное 3D) конфокальной микроскопии для визуализации флуоресцентно помечены отсеков в подающих надежды дрожжей. Метод был разработан для отслеживания динамики секретных отсеков в Pichia pastoris и Saccharomyces cerevisiae1,2,3. Этот протокол фокусируется на S. cerevisiae, который имеет нестоечный Golgi, вкотором отдельные цистерны оптически разрешимы4 . Необычная организация Golgi в S. cerevisiae позволила демонстрацию 4D микроскопией что цистерна Golgi первоначально маркирует с протеинами резидента предыдущих протеинов Golgi, и после этого теряет те протеины пока приобретающ резидента последние протеины Golgi3 ,5. Этот переход можно визуализировать, создавая штамм, в котором ранний белок Golgi Vrg4 помечен GFP, в то время как поздний белок Golgi Sec7 помечен мономерным красным флуоресцентным белком. Когда отдельные цистерны отслеживаются, созревание наблюдается как зелено-красное преобразование3. Этот тип анализа может предоставить ценную информацию о локализации белка и идентичности отсека. Например, два белка с слегка смещенным временем прибытия и отъезда иногда могут показаться, что они маркируют разные отсеки в статических изображениях, но их можно увидеть в 4D-фильмах, чтобы обозначить один и тот же отсек в разных временных точках6,7 . Таким образом, 4D микроскопия выявляет явления, которые в противном случае не были бы очевидны.
Информационная 4D микроскопия дрожжевых отсеков может быть достигнута с помощью соответствующих процедур и оборудования2. Когда это возможно, флуоресцентные пометки белка выполняется замена гена8, чтобы избежать переэкспрессии артефактов. Поскольку внутриклеточные структуры часто очень динамичны, 4D-изображение необходимо для обеспечения надежной обработки структуры с течением времени. В описанном здесь протоколе используется лазерный сканирующий конфокальный микроскоп, оснащенный детекторами высокой чувствительности. С помощью этого устройства, весь объем клеток S. cerevisiae может быть изображен конфокальной микроскопии примерно каждые 1-3 с, с 2 с интервалами является типичным. Данные могут быть собраны на срок до 5-15 мин в зависимости от плотности маркировки фторофоров и их фотофизических свойств. Основным препятствием является минимизация фотоотбелевания. Для этого интенсивность лазера сохраняется как можно ниже, скорость конфокального сканирования максимизируется, а оптические параметры настроены на изображение на пределе Nyquist, чтобы захватить соответствующую информацию, избегая при этом чрезмерного воздействия света. Эти настройки, как ожидается, также облегчить фототоксичность, фактор, который часто упускается из виду во время изображения живых клеток9,10,11. Полученные шумные данные обрабатываются с помощью алгоритмов коррекции отбеливателя и деконволюции для облегчения количественной оценки интенсивности флуоресценции.
Даже с высоким качеством 4D фильмов, анализ сложно, потому что дрожжевые отсеки, как правило, многочисленные, неоднородные, и мобильные. Из-за внутренних ограничений конфокальной микроскопии и неоптимальных настроек, необходимых для длительной 4D-визуализации, флуоресцентные структуры, которые находятся рядом друг с другом, трудно решить. Эту проблему можно обойти, сосредоточив внимание на небольшом количестве флуоресцентных структур, которые остаются оптически разрешимыми в течение периода маркировки, с предположением, что эти структуры являются репрезентативными для всей популяции маркированных Отделения. Флуоресцентные отсеки, которые можно надежно отслеживать, идентифицируются путем просмотра фильмов о проецируемом стеках и создания серии монтажей, в которых оптические секции для каждой временной точки выстраиваются на экране компьютера. В этом анализе используются пользовательские плагины ImageJ12, которые позволяют отслеживать индивидуальную структуру в изоляции.
Последние методы работы охватывает использование флуоресцентных белков в дрожжах13, а также теории и практики 4D конфокальной визуализации дрожжевых клеток2. Этот протокол фокусируется на ключевых практических аспектах эксперимента по визуализации 4D. Она включает в себя некоторые усовершенствования ранее описанных процедур, а также обновленные версии плагина ImageJ и документации. Показанный пример фокусируется на динамике Golgi, но этот протокол в равной степени подходит для визуализации других дрожжевых отсеков.
Protocol
Representative Results
Discussion
4D конфокальная визуализация дрожжевых органелл требует тщательной настройки нескольких параметров. Основной проблемой является фотоотбеление и фототоксичность. Типичный 4D фильм включает в себя сбор тысяч оптических секций, так что лазерное освещение должно быть как можно ниже. Танд?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом NIH R01 GM104010. Спасибо за помощь с флуоресценцией микроскопии Витас Bindokas и Кристин Лабно на комплексной микроскопии Основной фонд, который поддерживается NIH финансируемых онкологический центр Поддержка Грант P30 CA014599.
Materials
| 35 mm glass bottom dishes No. 1.5 | MatTek | P35G-0.170-14-C | Imaging dishes |
| Concanavalin A powder | Sigma-Aldrich | C2010 | |
| Trolox | Vector Laboratories | CB-1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Huygens Essential software, version 17.04 | Scientific Volume Imaging | Deconvolution software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software |
References
- Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris. Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).
- Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. 4D confocal imaging of yeast organelles. Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).
- Losev, E., et al. Golgi maturation visualized in living yeast. Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).
- Papanikou, E., Glick, B. S. The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries. FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).
- Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation. Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).
- Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. Budding yeast has a minimal endomembrane system. Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).
- Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. COPI selectively drives maturation of the early Golgi. eLife. 4, 13232 (2015).
- Rothstein, R. Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast. Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).
- Carlton, P. M., et al. Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).
- Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. A review of fluorescent proteins for use in yeast. Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).
- Day, K. J., et al. Improved deconvolution of very weak confocal signals. F1000Research. 6, 787 (2017).
- Bhave, M., et al. Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation. Journal of Cell Science. 127, 250-257 (2014).
- Rossanese, O. W., et al. A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).
- Connerly, P. L., et al. Sec16 is a determinant of transitional ER organization. Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).
- Genové, G., Glick, B. S., Barth, A. L. Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins. BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).
- Pawley, J. B. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , (2006).
- Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics. Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).
- Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
- Grimm, J. B., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
- Casler, J. C., et al. Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi. Journal of Cell Biology. , (2019).
