4D-Mikroskopie der Hefe
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Analyse von fluoreszierend markierten intrazellulären Kompartimenten in angehender Hefe mittels mehrfarbiger 4D-Konfokalmikroskopie (Zeitraffer-3D). Die bildgebenden Parameter werden ausgewählt, um geeignete Signale zu erfassen und gleichzeitig Photoschäden zu begrenzen. Benutzerdefinierte ImageJ-Plugins ermöglichen es, beschriftete Strukturen nachzuverfolgen und quantitativ zu analysieren.
Abstract
Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu charakterisieren, wie Membranfächer sich in lebenden Zellen angehender Hefe bilden und transformieren. Viele intrazelluläre Kompartimente in Hefe sind dynamisch, und ein vollständiges Verständnis ihrer Eigenschaften erfordert Zeitraffer-Bildgebung. Die mehrfarbige 4D-Konfokalfluoreszenzmikroskopie ist eine leistungsstarke Methode zur Verfolgung des Verhaltens und der Zusammensetzung eines intrazellulären Fachs auf einer Zeitskala von 5-15 min. Eine strenge Analyse der Fachdynamik erfordert die Erfassung von Tausenden von optischen Bereichen. Um dieses Ziel zu erreichen, werden Photobleaching und Phototoxizität durch schnelles Scannen bei sehr geringer Laserleistung minimiert, und die Pixelabmessungen und Z-Schritt-Intervalle werden auf die größten Werte eingestellt, die mit der Probenahme des Bildes in voller Auflösung kompatibel sind. Die resultierenden 4D-Datensätze sind laut, können aber durch Dekonvolution geglättet werden. Selbst bei qualitativ hochwertigen Daten ist die Analysephase eine Herausforderung, da intrazelluläre Strukturen oft zahlreich, heterogen und mobil sind. Um dieser Notwendigkeit gerecht zu werden, wurden benutzerdefinierte ImageJ-Plugins in Array-4D-Daten auf einem Computerbildschirm geschrieben, Strukturen von Interesse identifiziert, die Daten bearbeitet, um einzelne Strukturen zu isolieren, die Fluoreszenzzeitkurse zu quantifizieren und Filme der projizierten Z-Stacks zu machen. 4D-Filme sind besonders nützlich, um stabile Kompartimente von transienten Fächern zu unterscheiden, die sich durch Reifung umdrehen. Solche Filme können auch verwendet werden, um Ereignisse wie Die Kompartimentfusion zu charakterisieren und die Auswirkungen bestimmter Mutationen oder anderer Störungen zu testen.
Introduction
Die Fächer des Endomembransystems befinden sich im ständigen Fluss, und ihre vollständige Charakterisierung erfordert eine Live-Zell-Bildgebung. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das die konfokale 4D-Konfokalmikroskopie (Zeitraffer-3D) verwendet, um fluoreszierend beschriftete Fächer in angehenden Hefen zu visualisieren. Die Methode wurde entwickelt, um die Dynamik der Sekretoreifächer in Pichia pastoris und Saccharomyces cerevisiae1,2,3zu verfolgen. Dieses Protokoll konzentriert sich auf S. cerevisiae, das einen nicht gestapelten Golgi hat, in dem die einzelnen Zisternen optisch auflösbar sind4. Die ungewöhnliche Golgi-Organisation in S. cerevisiae ermöglichte die Demonstration durch 4D-Mikroskopie, dass eine Golgi-Zisterne zunächst mit ansässigen frühen Golgi-Proteinen etikettiert und dann diese Proteine verliert, während sie ansässige späte Golgi-Proteine erwirbt3 ,5. Dieser Übergang kann durch die Schaffung eines Stammes visualisiert werden, bei dem das frühe Golgi-Protein Vrg4 mit GFP beschriftet wird, während das späte Golgi-Protein Sec7 mit einem monomeren roten fluoreszierenden Protein gekennzeichnet ist. Wenn einzelne Zisternen verfolgt werden, wird die Reifung als Grün-Rot-Umwandlung3beobachtet. Diese Art der Analyse kann wertvolle Informationen über die Proteinlokalisierung und die Identität des Kompartiments liefern. Beispielsweise können zwei Proteine mit leicht versetzten Ankunfts- und Abfahrtszeiten manchmal verschiedene Fächer in statischen Bildern zu kennzeichnen scheinen, können aber in 4D-Filmen gesehen werden, um dasselbe Fach zu verschiedenen Zeitpunkten zu beschriften6,7 . So zeigt die 4D-Mikroskopie Phänomene auf, die sonst nicht erkennbar wären.
Informative 4D-Mikroskopie von Hefefächern kann mit geeigneten Verfahren und Ausrüstung2erreicht werden. Wann immer möglich, wird fluoreszierende Protein-Tagging durch Genersatz8 durchgeführt, um Überexpressionsartefakte zu vermeiden. Da intrazelluläre Strukturen oft sehr dynamisch sind, ist eine 4D-Bildgebung erforderlich, um sicherzustellen, dass eine Struktur im Laufe der Zeit zuverlässig nachverfolgt wird. Das hier beschriebene Protokoll verwendet ein laserscannendes Konfokalmikroskop, das mit hochempfindlichen Detektoren ausgestattet ist. Mit diesem Gerät kann das gesamte Zellvolumen von S. cerevisiae durch konfokale Mikroskopie etwa alle 1-3 s abgebildet werden, wobei 2 s Intervalle typisch sind. Die Daten können je nach Beschriftungsdichten der Fluorophore und ihren photophysikalischen Eigenschaften bis zu 5-15 min gesammelt werden. Die Haupthürde ist die Minimierung der Photobleichung. Zu diesem Zweck werden die Laserintensitäten so gering wie möglich gehalten, die konfokale Scangeschwindigkeit maximiert und die optischen Parameter so konfiguriert, dass sie am Nyquist-Grenzwert abbilden, um die relevanten Informationen zu erfassen und gleichzeitig eine übermäßige Lichteinwirkung zu vermeiden. Diese Einstellungen sollen auch die Phototoxizität lindern, ein Faktor, der bei der Live-Zell-Bildgebung oft übersehen wird9,10,11. Die resultierenden lauten Daten werden mit Bleichkorrektur- und Dekonvolutionalgorithmen verarbeitet, um die Quantifizierung von Fluoreszenzintensitäten zu erleichtern.
Selbst bei hochwertigen 4D-Filmen ist die Analyse schwierig, da Hefefächer in der Regel zahlreich, heterogen und mobil sind. Aufgrund der intrinsischen Einschränkungen der konfokalen Mikroskopie und der nicht optimalen Einstellungen, die für eine längere 4D-Bildgebung erforderlich sind, sind fluoreszierende Strukturen, die nahe beieinander liegen, schwer zu lösen. Dieses Problem kann umgangen werden, indem man sich auf die geringe Anzahl von fluoreszierenden Strukturen konzentriert, die für die Dauer des Etikettierungszeitraums optisch lösbar bleiben, wobei davon ausgegangen wird, dass diese Strukturen repräsentativ für die gesamte Population der markierten Fächer. Fluoreszierende Fächer, die zuverlässig nachverfolgt werden können, werden identifiziert, indem Filme von projizierten Z-Stacks angesehen und eine Reihe von Montagen erstellt werden, in denen die optischen Abschnitte für jeden Zeitpunkt auf einem Computerbildschirm angeordnet sind. Diese Analyse verwendet benutzerdefinierte ImageJ12 Plugins, die es ermöglichen, eine individuelle Struktur isoliert nachzuverfolgen.
Jüngste Methoden Papiere behandelt die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen in Hefe13 sowie die Theorie und Praxis der 4D konfokale Bildgebung von Hefezellen2. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die wichtigsten praktischen Aspekte eines 4D-Bildgebungsexperiments. Es enthält einige Verbesserungen an zuvor beschriebenen Verfahren sowie aktualisierte Versionen des ImageJ-Plugin-Codes und der Dokumentation. Das gezeigte Beispiel konzentriert sich auf die Golgi-Dynamik, aber dieses Protokoll eignet sich gleichermaßen für die Abbildung anderer Hefekomden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die konfokale 4D-Bildgebung von Hefeorganellen erfordert eine sorgfältige Abstimmung mehrerer Parameter. Das Hauptanliegen ist Photobleaching und Phototoxizität. Ein typischer 4D-Film beinhaltet das Sammeln von Tausenden von optischen Abschnitten, so dass die Laserbeleuchtung so gering wie möglich gehalten werden muss. Tandem fluoreszierende Protein-Tags können verwendet werden, um das Signal zu steigern, ohne die Expression des markierten Proteins16,17zu erh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss R01 GM104010 unterstützt. Vielen Dank für die Unterstützung bei der Fluoreszenzmikroskopie an Vytas Bindokas und Christine Labno in der Integrated Microscopy Core Facility, die vom NIH-finanzierten Cancer Center Support Grant P30 CA014599 unterstützt wird.
Materials
| 35 mm glass bottom dishes No. 1.5 | MatTek | P35G-0.170-14-C | Imaging dishes |
| Concanavalin A powder | Sigma-Aldrich | C2010 | |
| Trolox | Vector Laboratories | CB-1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Huygens Essential software, version 17.04 | Scientific Volume Imaging | Deconvolution software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software |
References
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