JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
생체공학

Måling af kraft-følsom Protein Dynamics i levende celler ved hjælp af en kombination af fluorescerende teknikker

Published: November 02, 2018
doi:
10.3791/58619
, ,
1Department of Biomedical Engineering,Duke University

Summary

Vi præsenterer her, en protokol til den samtidige brug af Förster resonans energi transfer-baseret spænding sensorer til at måle protein belastning og fluorescens opsving efter photobleaching til at måle protein dynamics muliggør måling af kraft-følsom protein dynamikken i levende celler.

Abstract

Celler fornemme og reagere på fysiske signaler i deres miljø ved at konvertere mekaniske stimuli til biokemisk påviselige signaler i en proces kaldet mechanotransduction. Et afgørende trin i mechanotransduction er overførslen af styrker mellem de eksterne og interne miljøer. Overføre kræfter, der skal være en vedvarende, ubrudt fysiske kobling lavet af en serie af protein-protein interaktioner. For en given protein-protein interaktion, mekanisk belastning kan enten har ingen indvirkning på samspillet, føre til hurtigere afstandtagen af interaktionen, eller endda stabilisere interaktionen. Forstå hvordan molekylære belastning dikterer protein omsætning i levende celler kan give værdifulde oplysninger om den mekaniske stat af et protein, igen belyse dens rolle i mechanotransduction. Eksisterende teknikker til måling af kraft-følsom protein dynamics enten mangler direkte målinger af protein belastning eller stole på målinger foretaget uden for den trådløse forbindelse. Her, beskriver vi en protokol for Förster resonans overførsel-fluorescens energiudnyttelse efter photobleaching (FRET-FRAP) teknik, som giver mulighed for måling af kraft-følsom protein dynamikken i levende celler. Denne teknik er potentielt relevant for enhver FRET-baserede spænding sensor, lette undersøgelsen af kraft-følsom protein dynamics i række subcellulært strukturer og i forskellige celletyper.

Introduction

Det ekstracellulære miljø er en rig kilde af biokemiske og fysiske signaler, der dikterer celle adfærd. Navnlig kan den fysiske natur af mikromiljø mægle cellulære funktioner, herunder cellevækst, migrering og differentiering1,2,3,4. Dysregulering af mekanikken i mikromiljø er et afgørende element til mange sygdomme, der endnu ikke har tilstrækkelig behandlinger, såsom kræft5, åreforkalkning6og fibrose7. Fuld forståelse for, hvordan celler konvertere fysiske stimuli til biokemisk påviselige signaler, en proces, der kaldes mechanotransduction, kræver udredning af de molekylære mekanismer mægle kraft transmission, både ind og ud af cellerne og inden for flere subcellulært strukturer.

Inde subcellulært strukturer, proteiner konstant drejning over; bindende og adskillelsen baseret på styrken af deres interaktioner med bindende partnere8. For styrker indberettes med succes på tværs af en fysisk afstand, skal der være en ubrudt kæde af protein-protein interaktioner, hvilket betyder, at et protein omsætning skal være langsomt nok til at opretholde og overføre kraft til dets bindende partner9. Mens protein-protein interaktioner består som regel af flere ikke-kovalente bindinger mellem protein domæner, er samspillet ofte udtænkt som en bundne stat, der kan overgang til en ubundet stat under forskellige betingelser10, 11. for et givet protein-protein interaktion, er det muligt at styrke kan har ingen effekt på levetiden for interaktion, kendt som en “ideel bond”, reducere levetiden for interaktion, kendt som en “slip bond”, eller øge levetiden for interaktionen , kendt som en “catch bond”10. Der er således en indviklede forhold mellem protein belastning og protein dynamik, som vi refererer til som kraft-følsom dynamics.

Mod forståelse effekten af belastningen på bond dynamics, har en række yderst informativ eksperimenter udført på enkelt-molekyle niveau. Ved hjælp af isolerede proteiner eller fragmenter af proteiner og manipulation teknikker såsom magnetiske pincet, Optisk pincet og atomic force mikroskopi, viste disse undersøgelser kraft-følsom protein-protein interaktioner for flere relevante proteiner11,12. Begge integriner13 og cadherins14, som er transmembrane proteiner, der er vigtige for at danne celle-matrix og celle-celle interaktioner, henholdsvis, har vist ændringer i dynamics grund til at indlæse. Inden for cellen, vinculin er rekrutteret til både Kamilla15 og α-catenin16 i en kraft-afhængige måde og kan danne en fangst obligation med aktin17, der angiver en afgørende rolle for vinculin på både fokal sammenvoksninger (FAs) og adherens vejkryds (AJs ) under belastning. Enkelt-molekyle studier tillader dyrkning af specifikke protein-protein interaktioner og give entydige resultater, men de højde ikke for kompleksiteten af den cellulære miljø.

Landmark eksperimenter viste, at flere subcellulært strukturer, herunder FAs og AJs, er mechanosensitive, og udviser forøget forsamling i svar til internt genereret eller eksternt anvendt belastninger18,19, 20,21,22. Flere teoretiske modeller har derudover foreslået, at mechanosensitive forsamling kunne være drevet af kraft-følsom protein dynamics23,24,25. For at undersøge disse kraft-følsom dynamikken i levende celler, har et par indirekte strategier truffet. FRAP og relaterede teknikker giver en relativt enkel metode til måling af protein dynamics i celler26,27,28,29. Måling af protein belastning har imidlertid været mere begrænset. En typisk metode er at sammenligne protein dynamics i celler med og uden udsættelse for en cytoskeletal inhibitor anvendes til at reducere overordnede celle kontraktilitet8,30,31. Begrebsmæssigt, er dette en sammenligning mellem en høj last og lav belastning tilstand. Men der er ingen kvantificering af belastningen på tværs af proteinet i enten tilstand, og der kan være utilsigtede biokemiske effekter af inhibitor, sådanne tab af vigtige bindingssteder langs en F-actin glødetråd. En anden tilgang, specifikke for FAs, har været at måle samlede kraft anstrengelse på underlag af FA benytter trækkraft force mikroskopi til at tilnærme molekylære belastning og undersøge forholdet med dynamikken i en enkelt protein inden for FA32. Mens denne tilgang giver mulighed for kvantificering af samlede kraft, giver det ikke molekylemæssigt specifikke oplysninger. FAs består af over 200 forskellige proteiner, hvoraf mange kan bære belastning33. Således måler den samlede kraft output af en FA potentielt tilslører muligheden for flere kraft transmission veje og pålideligt giver ikke en foranstaltning af belastningen på et specifikt protein.

I modsætning til tidligere tilgange i mechanobiology, fremkomsten af FRET-baserede spænding sensorer giver mulighed for direkte måling af belastninger opleves af specifikke proteiner i levende celler34,35,36. Vi præsenterer her, en protokol, der kombinerer FRET-baserede spænding sensorer med FRAP-baserede mål for protein dynamics. Vi henviser til denne teknik som FRET-FRAP. Denne tilgang gør det muligt samtidig måling af protein belastning og protein dynamik, således at vurderingen af kraft-følsom protein dynamikken i levende celler (figur 1). Allerede, er FRET-FRAP teknik blevet anvendt til undersøgelse af kraft-følsom dynamikken i mekanisk linker protein vinculin37. Spænding sensorer er blevet udviklet for mange proteiner, der er relevante i en lang række subcellulært strukturer. For eksempel er sensorer udviklet til vinculin34 og Kamilla38,39 i FAs, cadherins og catenins i AJs40,41,42, nesprin i den nukleare Anna komplekse 43, α-actinin44 og filamin36 i cytoskeleton, og MUC-1 i glycocalyx45, blandt andre46. FRAP er ligeledes et almindeligt anvendte teknik er blevet brugt på mechanosensitive proteiner i fokale sammenvoksninger8,31, adherens vejkryds47, actin cortex26og nucleus48. Bevæger sig fremad, FRET-FRAP teknik bør generelt gælder for nogen af disse eksisterende sensorer eller nyligt udviklet sensorer, giver mulighed for målinger af force-følsomme dynamik i en bred vifte af subcellulært strukturer og sammenhænge. I denne retning leverer vi en detaljeret, generaliseret protokol for at gennemføre de FRET-FRAP teknik gælder i disse forskellige systemer. Forhåbentlig, dette vil give en lang række eksperimenter belyse roller i forskellige mechanosensitive proteiner i regulere kraft transmission og mægle celle adfærd.

Protocol

1. generere prøver til billedbehandling Stabilt udtrykkelige spænding sensor konstruktion i ønskede celletype. Klon spænding sensor konstruktion i pRRL vektor eller andre virale udtryk plasmid.Bemærk: Flere forskellige molekylære kloning værktøjer er tilgængelige til at opnå dette skridt, herunder anvendelse af restriktionsenzymer, overlappe forlængelse og Gibson forsamling35. PRRL vektor bruges i lenti viral transduktion og giver mulighed for en betydelig grad af …

Representative Results

FRET-FRAP består af en kombination af to fluorescerende teknikker, ÆRGRE og FRAP. Vi fokuserede på virkningerne af protein belastning, brugte vi FRET-baserede spænding sensorer34,46. Disse sensorer er ofte baseret på en spænding sensing modul består af to fluorescerende proteiner, såsom mTFP1 og VenusA206K, forbundet af en flagelliform linker (figur 1A). Når modulet er placeret mellem hoved o…

Discussion

Metoden FRET-FRAP giver mulighed for direkte måling af kraft-følsom protein dynamics, en egenskab, der har været vanskelige at direkte sonde indeni levende celler. Følsomheden af protein dynamics til molekylære belastning er afgørende for proteinets funktion som en kraft senderen eller transducer. Læsning er nødvendige til transmission af både internt genereret og eksternt anvendt styrker, kaldet mechanotransmission, og en konvertering af disse styrker til biokemisk påviselige signaler, kaldet mechanotransducti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af en National Science Foundation karriere Award (NSF-CMMI-14-54257) samt tilskud fra American Heart Association (16GRNT30930019) og National Institutes of Health (R01GM121739-01) tildeles Dr. Brenton Hoffman og en National Science Foundation Graduate Research Fellowship tildeles Katheryn Rothenberg. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af NSF eller NIH.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25300062
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4
60x Objective NA1.35 Olympus UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062
Automated Stage Prior Scientific H117EIX3
Custom Dichroic Mirror Chroma Technology Corp T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter Chroma Technology Corp ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter Chroma Technology Corp ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter Chroma Technology Corp ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium Sapphire MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Sigma Aldrich D5796 with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum HyClone SH30396.03
Fibronectin, Human Corning 47743-654
FRAPPA Calibration Slide Andor provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes World Precision Instruments FD35
HEK293-T Cells ATCC CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene Sigma Aldrich H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma Aldrich D6429
Inverted Fluorescent Microscope Olympus IX83
JMP Pro Software SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels Sutter Instruments LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb Sutter Instruments LS/OF30
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
MATLAB Software Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher 11140050
MetaMorph for Olympus Olympus
Micro-Humidification System Bioptechs 130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Objective Heater Medium Bioptechs 150819-13
OptiMEM Thermo Fisher 31985070
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537
pMD2.G Envelope Plasmid Addgene 12259
pRRL Vector gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid Addgene 12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher 75004505
Stable Z Stage Warmer Bioptechs 403-1926
Venus Emission Filter Semrock FF01-571/72
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  2. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), 1407-1420 (2010).
  3. Sun, Y., Chen, C. S., Fu, J. Forcing stem cells to behave: a biophysical perspective of the cellular microenvironment. Annual Review of Biophysics. 41, 519-542 (2012).
  4. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development: a growing role for contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 34-43 (2009).
  5. Broders-Bondon, F., Nguyen Ho-Bouldoires, T. H., Fernandez-Sanchez, M. E., Farge, E. Mechanotransduction in tumor progression: The dark side of the force. The Journal of cell biology. 217 (5), 1571-1587 (2018).
  6. Simmons, R. D., Kumar, S., Jo, H. The role of endothelial mechanosensitive genes in atherosclerosis and omics approaches. Archives of Biochemistry and Biophysics. 591, 111-131 (2016).
  7. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  8. Lele, T. P., et al. Mechanical forces alter zyxin unbinding kinetics within focal adhesions of living cells. Journal of Cellular Physiology. 207 (1), 187-194 (2006).
  9. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
  10. Dembo, M., Torney, D. C., Saxman, K., Hammer, D. The reaction-limited kinetics of membrane-to-surface adhesion and detachment. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 234 (1274), 55-83 (1988).
  11. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Molecular-Scale Tools for Studying Mechanotransduction. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 287-316 (2015).
  12. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  13. Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1275-1284 (2009).
  14. Rakshit, S., Zhang, Y., Manibog, K., Shafraz, O., Sivasankar, S. Ideal catch, and slip bonds in cadherin adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (46), 18815-18820 (2012).
  15. del Rio, A., et al. Stretching Single Talin Rod Molecules Activates Vinculin Binding. Science. 323 (5914), 638-641 (2009).
  16. Seddiki, R., et al. Force-dependent binding of vinculin to alpha-catenin regulates cell-cell contact stability and collective cell behavior. Molecular Biology of the Cell. 29 (4), 380-388 (2018).
  17. Huang, D. L., Bax, N. A., Buckley, C. D., Weis, W. I., Dunn, A. R. Vinculin forms a directionally asymmetric catch bond with F-actin. Science. 357 (6352), 703-706 (2017).
  18. Chrzanowska-Wodnicka, M., Burridge, K. Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesions. The Journal of Cell Biology. 133 (6), 1403-1415 (1996).
  19. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  20. Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Science. 107 (22), 9944-9949 (2010).
  21. Riveline, D., et al. Focal contacts as mechanosensors: externally applied local mechanical force induces growth of focal contacts by an mDia1-dependent and ROCK-independent mechanism. The Journal of Cell Biology. 153 (6), 1175-1186 (2001).
  22. Brevier, J., Vallade, M., Riveline, D. Force-extension relationship of cell-cell contacts. Physical Review Letters. 98 (26), 268101 (2007).
  23. Bershadsky, A., Kozlov, M., Geiger, B. Adhesion-mediated mechanosensitivity: a time to experiment, and a time to theorize. Current opinion in cell biology. 18 (5), 472-481 (2006).
  24. Chan, C. E., Odde, D. J. Traction dynamics of filopodia on compliant substrates. Science. 322 (5908), 1687-1691 (2008).
  25. Wu, Z., Plotnikov, S. V., Moalim, A. Y., Waterman, C. M., Liu, J. Two distinct actin networks mediate traction oscillations to confer focal adhesion mechanosensing. Biophysical Journal. 112 (4), 780-794 (2017).
  26. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
  27. McNally, J. G. Quantitative FRAP in analysis of molecular binding dynamics in vivo. Methods of Cell Biology. 85, 329-351 (2008).
  28. Wehrle-Haller, B. Analysis of integrin dynamics by fluorescence recovery after photobleaching. Methods in Molecular Biology. 370, 173-202 (2007).
  29. Carisey, A., Stroud, M., Tsang, R., Ballestrem, C. Fluorescence recovery after photobleaching. Methods of Molecular Biology. 769, 387-402 (2011).
  30. Carisey, A., et al. Vinculin regulates the recruitment and release of core focal adhesion proteins in a force-dependent manner. Current Biology. 23 (4), 271-281 (2013).
  31. Wolfenson, H., Bershadsky, A., Henis, Y. I., Geiger, B. Actomyosin-generated tension controls the molecular kinetics of focal adhesions. Journal of Cell Science. 124, 1425-1432 (2011).
  32. Dumbauld, D. W., et al. How vinculin regulates force transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), 9788-9793 (2013).
  33. Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma’ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature Cell Biology. 9 (8), 858-867 (2007).
  34. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  35. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Biophysical Methods in Cell Biology. 125, 161-186 (2015).
  36. Meng, F., Suchyna, T. M., Sachs, F. A fluorescence energy transfer-based mechanical stress sensor for specific proteins in situ. The FEBS Journal. 275 (12), 3072-3087 (2008).
  37. Rothenberg, K. E., Scott, D. W., Christoforou, N., Hoffman, B. D. Vinculin Force-Sensitive Dynamics at Focal Adhesions Enable Effective Directed Cell Migration. Biophysical journal. 114 (7), 1680-1694 (2018).
  38. Austen, K., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nature Cell Biology. 17 (12), 1597-1606 (2015).
  39. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. The Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
  40. Acharya, B. R., et al. Mammalian Diaphanous 1 Mediates a Pathway for E-cadherin to Stabilize Epithelial Barriers through Junctional Contractility. Cell Reports. 18 (12), 2854-2867 (2017).
  41. Borghi, N., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (31), 12568-12573 (2012).
  42. Conway, D. E., Williams, M. R., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Endothelial cell responses to atheroprone flow are driven by two separate flow components: low time-average shear stress and fluid flow reversal. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), H367-H374 (2010).
  43. Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
  44. Ye, N., et al. Direct observation of alpha-actinin tension and recruitment at focal adhesions during contact growth. Experimental Cell Research. 327 (1), 57-67 (2014).
  45. Paszek, M. J., et al. The cancer glycocalyx mechanically primes integrin-mediated growth and survival. Nature. 511 (7509), 319-325 (2014).
  46. Gayrard, C., Borghi, N. FRET-based Molecular Tension Microscopy. Methods. 94, 33-42 (2016).
  47. de Beco, S., Gueudry, C., Amblard, F., Coscoy, S. Endocytosis is required for E-cadherin redistribution at mature adherens junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (17), 7010-7015 (2009).
  48. Östlund, C., et al. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. Journal of Cell Science. 122 (22), 4099-4108 (2009).
  49. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . The interactions of retroviruses and their hosts. , (1997).
  50. Komatsubara, A. T., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative analysis of recombination between YFP and CFP genes of FRET biosensors introduced by lentiviral or retroviral gene transfer). Scientific Reports. 5, 13283 (2015).
  51. Nasri, M., Karimi, A., Farsani, M. A. Production purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
  52. . Generating Stable Cell Lines with Lentivirus Available from: https://www.addgene.org/protocols/generating-stable-cell-lines (2016)
  53. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 45 (3), 194-205 (2001).
  54. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), e18586 (2011).
  55. Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical journal. 91 (5), L39-L41 (2006).
  56. Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (3), 364-382 (2015).
  57. Carnell, M., Macmillan, A., Whan, R. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP): acquisition, analysis, and applications. Methods of Molecular Biology. 1232, 255-271 (2015).
  58. Trembecka, D. O., Kuzak, M., Dobrucki, J. W. Conditions for using FRAP as a quantitative technique–influence of the bleaching protocol. Cytometry A. 77 (4), 366-370 (2010).
  59. Lavelin, I., et al. Differential effect of actomyosin relaxation on the dynamic properties of focal adhesion proteins. PLoS One. 8 (9), e73549 (2013).
  60. Foote, H. P., Sumigray, K. D., Lechler, T. FRAP analysis reveals stabilization of adhesion structures in the epidermis compared to cultured keratinocytes. PLoS One. 8 (8), e71491 (2013).
  61. Zal, T., Gascoigne, N. R. Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3923-3939 (2004).
  62. Hodgson, L., Shen, F., Hahn, K. Biosensors for characterizing the dynamics of rho family GTPases in living cells. Current Protocols in Cell Biology. 46 (1), (2010).
  63. Day, R. N. Measuring protein interactions using Förster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
  64. Rapsomaniki, M. A., et al. easyFRAP: an interactive, easy-to-use tool for qualitative and quantitative analysis of FRAP data. Bioinformatics. 28 (13), 1800-1801 (2012).
  65. Zamir, E., et al. Molecular diversity of cell-matrix adhesions. Journal of cell science. 112 (11), 1655-1669 (1999).
  66. Bakolitsa, C., et al. Structural basis for vinculin activation at sites of cell adhesion. Nature. 430 (6999), 583-586 (2004).
  67. De Los Santos, C., Chang, C. W., Mycek, M. A., Cardullo, R. FRAP, FLIM, and FRET: Detection and analysis of cellular dynamics on a molecular scale using fluorescence microscopy. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 587-604 (2015).
  68. Periasamy, A., Wallrabe, H., Chen, Y., Barroso, M. Chapter 22: Quantitation of protein-protein interactions: confocal FRET microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 569-598 (2008).
  69. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
  70. Zeug, A., Woehler, A., Neher, E., Ponimaskin, E. G. Quantitative intensity-based FRET approaches–a comparative snapshot. Biophysical Journal. 103 (9), 1821-1827 (2012).
  71. Ehrlicher, A. J., Nakamura, F., Hartwig, J. H., Weitz, D. A., Stossel, T. P. Mechanical strain in actin networks regulates FilGAP and integrin binding to filamin A. Nature. 478 (7368), 260-263 (2011).
  72. Guo, B., Guilford, W. H. Mechanics of actomyosin bonds in different nucleotide states are tuned to muscle contraction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (26), 9844-9849 (2006).
  73. Lee, C. Y., et al. Actin depolymerization under force is governed by lysine 113:glutamic acid 195-mediated catch-slip bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (13), 5022-5027 (2013).
  74. Cost, A. L., Ringer, P., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. How to Measure Molecular Forces in Cells: A Guide to Evaluating Genetically-Encoded FRET-Based Tension Sensors. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (1), 96-105 (2015).
  75. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nature Cell Biology. 19 (1), 28-37 (2017).
  76. Case, L. B., et al. Molecular mechanism of vinculin activation and nanoscale spatial organization in focal adhesions. Nature Cell Biology. 17 (7), 880-892 (2015).
  77. Chen, H., Cohen, D. M., Choudhury, D. M., Kioka, N., Craig, S. W. Spatial distribution and functional significance of activated vinculin in living cells. The Journal of Cell Biology. 169 (3), 459-470 (2005).
  78. Kim, T. J., et al. Dynamic visualization of alpha-catenin reveals rapid, reversible conformation switching between tension states. Current Biology. 25 (2), 218-224 (2015).
  79. Yao, M., et al. Mechanical activation of vinculin binding to talin locks talin in an unfolded conformation. Scientific reports. 4, 4610 (2014).

Tags

Keywords: Force-sensitive Protein DynamicsFluorescent TechniquesMechanobiologyVinculinTalinCadherinsNesprinTension Sensor ConstructFibronectinFRAP LaserAcceptor FluorophoreMechanically-sensitive ProteinsCell-cell InteractionsCell-environment InteractionsMolecular ScaleLiving Cells
check_url/kr/58619?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image