小鼠肝脏消化对淋巴内皮细胞的流式细胞仪分析
Summary
该方案的目标是使用所述标记识别肝脏内的淋巴管内皮细胞群。我们利用胶原酶 iv 和 dnase 和组织的温和切碎, 结合流式细胞仪, 以确定一个独特的淋巴内皮细胞的群体。
Abstract
在肝脏内, 淋巴血管被发现在门静脉三位一体, 其描述的功能是去除间质液体从肝脏到淋巴结, 在那里细胞碎片和抗原可以被调查。我们非常有兴趣了解淋巴血管可能如何参与肝脏内的炎症和免疫细胞功能。然而, 很少有发现建立消化方案, 用于分离淋巴内皮细胞 (lec) 从肝脏或特定的标记, 可用于评估肝脏 lec 的基础上, 每个细胞。因此, 我们优化了肝脏消化和染色的方法, 以评估肝脏中的 lec 群体。我们相信, 这里概述的方法将有助于识别和隔离肝脏中的 lec, 并将加强我们对 lec 如何响应肝脏微环境的理解。
Introduction
淋巴管和 lec 在肝脏中的作用尚不清楚。虽然淋巴血管被发现在肝1的门静脉三位一体和扩大期间的疾病 2, 很少了解在肝脏内的 lec 的功能和表型。随着主要在 lecs3上发现的标记物的发现, 这些细胞在不同组织位中的重要性将在稳态和疾病中填补我们理解中的一个重大空白。lec 通过与 t 细胞4、5、6、7、8、9,10,11,12,13. 淋巴结中的 lec 可通过与迁移的树突状细胞14、15、16的相互作用来促进保护性免疫。因此, 有多个角色的 loec, 这可能是特定的组织和相互作用, 其中存在。然而, 对 lec 如何与组织中的免疫细胞相互作用或 lec 如何在不同器官系统中发挥作用的了解很少;因此, 在肝脏或其他器官内的每个细胞的基础上评估 lec 可能会导致 lec 如何编程组织特异性免疫的进步。虽然许多关注肝脏中 lec 的文献都使用显微镜来可视化 lec, 使用一个或两个标记和形态学 17, 但通过一项研究, 很少用流式细胞仪在细胞上专门评估细胞上的 lec评估了肝窦内皮细胞 (lsecs) 和lec 18之间的差异。通过流式细胞仪分析肝脏中的 lec 群体, 可以深入研究正常稳态或疾病期间的 lec 表型。
为了通过流式细胞仪评估 lec, 需要多个表面标记。通常情况下, lec 是可视化的表达与繁荣相关的同源毒素 1 (prox-1), 淋巴管内皮透明质酸受体 1 (lyve1) 或血管生长因子受体 3 (vegfr3) 使用显微镜。然而, 在肝脏中, 这些标记的表达并不局限于 lec。prox-1 在肝脏发育、再生和损伤19过程中广泛由肝细胞表达, lyve1 和 vegfr3 由肝正弦内皮细胞18表达。在淋巴结中, 利用流式细胞术将 lec 确定为分化 (cd) cd45 (cd31 +)、cd31 + 和 podoplanin + (pdpn)16。然而, 这种方法是太小, 无法分离肝脏中的 lec, 因为 cd45-cd1+ 细胞将捕获内皮细胞, 而肝脏中的血管内皮细胞的主要群体是 lsec。因此, 需要其他标记来区分罕见的 lec 人口和丰富的 lsec 人口。ccux32 (由成熟的 lsecs18表达) 和 cd146 (一种常见的血管内皮细胞标记, 主要由肝脏窦内皮细胞20在肝脏窦内表达, 几乎没有淋巴表达内皮细胞21) 是候选标记。
因此, 我们利用上述标记 cd45、cd31、cd146、cc到146和 pdpn 对肝脏中的 lec 进行了隔离和可视化的方法, 用于流式细胞术。我们描述了使用胶原酶 iv, dnase 1, 和机械分离肝脏组织消化成单细胞悬浮液。我们还描述了使用碘沙诺密度梯度分离非实质细胞 (npc) 和消除细胞碎片。最后, 利用多个标记, 我们确定了以 pdpn 为主要标记的最佳流式细胞术分控策略, 以肝脏中的 lec 为主要标记。
Protocol
这里描述的所有方法都已得到科罗拉多大学安舒茨医学校园动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。 1. 材料的制备 在磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中制备 dnase i 的 5 mgml 溶液。 在点击的 ehaa 培养基中加入 5, 000 u\ l 胶原酶 iv, 制作消化混合物。 使用前, 将消化混合物在37°c 下加热30分钟。 在汉克斯平衡盐溶液 (hbss) 中加入4.8% 的…
Representative Results
分析肝脏淋巴管的研究主要是使用免疫组织化学来定量肝脏中淋巴管的频率和直径。然而, 这种方法不允许评价 lec 的细胞的基础上, 细胞的基础上, 或表达多个标记, 细胞因子, 趋化因子, 或转录因子。因此, 我们询问是否可以从肝脏中分离肝脏 lec, 并使用流式细胞仪进行评估。以前的工作分离淋巴结 lec 是使用自由酶 dl (胶原酶-i————————<…
Discussion
lec 在免疫稳态和调节中的整体重要性最近被曝光25。许多发表的淋巴文献都集中在皮肤和淋巴结上;然而, 淋巴管在全身26被发现 , 因此, 我们需要了解它们在不同器官中的重要性。在这里, 我们展示了一种方法, 其中包括一种逐细胞研究肝脏中的 lec 的方法, 以更好地了解其同时表达的不同表面标记、细胞因子、趋化因子和细胞内蛋白质, 如转录因子。该方法将有?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢 gi 和肝脏先天免疫计划为这个项目提供的资金支持。b. a. j. t. 的资金也来自 r01 ai121209。
Materials
| Clicks/EHAA media | Irvine Scientific | 9195 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
| DNase I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | Deoxyribonuclease 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Density Gradient Medium |
| V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1 | BD biosciences | 562232 | |
| FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1 | Biolegend | 134706 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31( clone 390) | Biolegend | 102420 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN) |
| APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11 | Biolegend | 103138 | |
| FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) | Biolegend | 101306 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32( clone 93) | Biolegend | 101324 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| ghost red 780 viability dye | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
| APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
| FITC rat IgG2 (clone eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
| Anti mouse LYVE1 (clone 223322) | R&D systems | FAB2125A | |
| anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) | abcam | ab181598 | |
| anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA (fraction V) | Fischer | BP1600-100 | Bovine Serum Albumin (BSA) |
| Goat serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer |
| Ammonium Chloride | Fischer | A687-500 | for RBC Lysis buffer |
| Potassium Bicarbonate | Fischer | P184-500 | for RBC Lysis buffer |
| Scalpel | Feather | 2975#21 | |
| 100um cell strainer | Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | in house/ATCC | ATCC HB-197 | FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11550 | |
| 96 well plate | Corning | 3788 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| 50 ml conical | Truline | TR2004 | |
| 15 ml conical | Falcon | 352196 | |
| 1 ml Pipete tip | USA scientific | 1111-2721 | |
| 200 µl pipete tip | USA scientific | 1110-1700 | |
| 10 µl pipete tip | USA scientific | 1111-3700 | |
| seriological 10ml pipete | greiner bio-one | 607107 | |
| seriological 5ml pipete | greiner bio-one | 606107 | |
| Cell incubator | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II flow cytometer | BD biosciences | ||
| Clinical Centrifuge | Beckman coulter | model X-14R |
References
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Cite This Article
Finlon, J. M., Burchill, M. A., Tamburini, B. A. J. Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (143), e58621, doi:10.3791/58621 (2019).