유전자 인코딩된 표면 접착 구조물의 광 자극을 사용 하 여 높은 해상도와 대장균 박테리아 biofilms 임의의 공간 패턴에 입금 하는 방법을 설명 합니다.
공간 구조와 패턴 박테리아 biofilms에서 중요 한 역할을 재생합니다. 여기 높은 공간 해상도에서 임의의 공간 패턴으로 대장균 biofilms 경작에 대 한 접근 방법을 설명 합니다. 기술은 유전자 인코딩된 optogenetic 구문을 사용 하 여-pDawn-Ag43-그 푸른 빛에 의해 광 자극에 대장균 에서 biofilm 형성 커플. 우리는 pDawn Ag43 박테리아를 사용 하 여 패턴된 biofilms 경작 필요한 광학 설정 및 프로토콜 준비 pDawn Ag43와 대장균 을 변형 하는 과정 선발. 이 프로토콜을 사용 하 여, 25 μ m 아래 공간 해상도 biofilms 다양 한 표면에 소, 깨끗 한 객실 시설, 또는 표면 전처리 필요 없이 동봉 된 챔버를 포함 하 여 환경 패턴 수 있습니다. 기술은 편리 하 고 가변 제어할 biofilm 패턴화 biofilm 구조의 효과 조사 하는 응용 프로그램에서 사용 하기 위해 적절 한입니다. 더 넓게, 그것은 또한 생체 재료, 교육, 및 바이오-예술에서 잠재적인 응용 프로그램 있다.
Biofilms, 미생물의 표면에 부착 된 사회 이며 그들의 강한 구조-기능을 위해 유명 하다. 공간 형상과 biofilms의 패턴화 재생 중요 한 역할 전체 커뮤니티 기능 (와 반대로)1. 작은 길이 조정 biofilm 구조에 참여-수십 미크론2순서-어려운 문제를 패턴화 하는 biofilm의 가변 및 편리한 컨트롤. 여기 우리는 biofilms 광학 조명에 따라 정확 하 게 패턴된에서 임의의 형상 되도록 허용 하는 프로토콜을 보여 줍니다.
여기에 제시 된 프로토콜 사용 하 여 pDawn-Ag433, Ag43의 식 운전 하 여 대장균 박테리아에 biofilm 형성 광학 조명에 커플 optogenetic 구문 (는 adhesin 유전자 표면 접착 biofilm에 대 한 책임 대형) pDawn4 (광학 조명에 의해 제어 transcriptional 규칙)의 통제. 방법은 사용 하기 편리 하 고 다양 한에 패턴 biofilms 환경, 동봉된 (투명 한) 문화 챔버를 포함 하 여 표면 수 있습니다. 드롭릿 기반 증 착5 또는 표면 prepatterning/치료6, 등 기존 세포 증 착 방법에 비해 pDawn Ag43 뒤틀림 또는 클린 룸 시설을 필요 하지 않습니다. 그리고 그 이상의 재료를 필요로 하지 않습니다. 일반적인 미생물학 실험실을 사용할 수 있습니다. 그것은 자연스럽 게 기존에 microcolonies의 공간 크기를 접근 25 μ m 아래 공간 해상도 패턴 수 biofilms2. 전반적으로,이 기술은 biofilm 구조는 다음 세균성 지역 사회7microecology를 공부 하는 많은로 조작 하는 기능을 제공 합니다. 또한, 패턴된 biofilms 유용한 바이오8,9하는 편리한 플랫폼을 제공할 수 있습니다. 이 문서에서 우리 biofilms pDawn Ag43를 사용 하 여 패턴에 필요한 기본적인 프로토콜을 토론 하 고 잠재적인 수정 및 메서드에 관련 문제 해결.
Biofilm 구조 제어를 허용 하는 연구 도구에 대 한 필요성에 비추어 우리는 pDawn-Ag43 optogenetic 구문을 사용 하 여 박테리아 biofilms 패턴화를 위한 사용 하기 쉬운 프로토콜을 제시 했습니다. 이 기술로 대장균 biofilms 광학 25 μ m 아래 공간 해상도 함께 동봉 된 챔버를 포함 하 여 다양 한 표면 환경에 꽃무늬 될 수 있습니다.
전반적으로,이 프로토콜 세분화 될 수 있습니다 4 개의 주요 섹션으로: pDawn Ag43 박테리아의 준비 (1), (2) 광학의 준비 및 문화 설정 하드웨어, (3) 사전 조명 세균성 성장 단계, 및 (4) 후 조명 린스와 영상입니다.
섹션 1의 중요 한 부분은 관심의 E. 콜라이 긴장으로 pDawn Ag43 플라스 미드의 성공적인 변환. 이 높은-품질 순화 된 플라스 미드를 분리 하 고 생성 하는 변환에 대 한 높은-품질 유능한 세포에 의해 촉진 된다 (표 1, 문제 해결).
섹션 2의 중요 한 부분을 조명 강도 50 μW/cm2 460 nm 파장에 조정 되 고 프로젝터 제대로 biofilm 샘플 높이에 초점을 맞춘 프로젝터 설정의 최적화입니다. Note이 프로토콜에서 우리는 거꾸로 조명 설정 어디 프로젝터 빛나는 빛 아래에서, 위쪽으로 향해 biofilm 샘플 설명. 이 설정의 장점은 빛만 해야 한다는 biofilm 형성 표면에 도달 하기 전에 문화 접시의 바닥을 통해 여행. 조명 빛은 성장 과정 중 흐리고 planktonic 셀으로 가져옵니다 biofilm 표면 위에 액체 매체를 통해 여행 하는 의미에서. 이러한 우려 뿐만 아니라 그것은 또한 예를 들어 인큐베이터의 내부에 반사 표면을 취재 하 여 광학 설정 가능한 만큼, 길 잃은 빛을 최소화 하는 것이 중요-이 선명한 꽃무늬 biofilms를 얻을 하는 데 도움이. 관련된 메모에서 선명 biofilm 패턴 또한 조명 패턴 (그림 3D, 그림 4C)를 제어 하는 포토 마스크를 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 문제 해결을 요구 하는 일반적인 문제는 컴퓨터 소프트웨어 뿐만 아니라 프로젝터 신뢰성 문제는 biofilm 성장 (예, 30 ° C) 낮은 온도에서 배양 하 여 최소화 될 수 있다, 더 높은 온도 (예, 37 ° C)에서 포함 하는 운영 체제 업데이트 또는 하룻밤 성장 (표 1) 중에 필터링 하는 푸른 빛을 발생 합니다. 그것은 또한 중요 하, 프로젝터 및 인큐베이터 모델 사용, 따라는 것도 가능한 프로젝터에서 생성 된 열 인큐베이터 설정 수정 해야 할 수 있는 온도 보다 높은 실내 온도에서 발생 합니다.
전에 그들은 조명에 의해 유도 된다 제 3의 중요 한 부분 안정적이 고 반복 가능한 세균 샘플을 얻는 이다. 이러한 이유로 것이 좋습니다 한 천 배지에서 그들을 밖으로 줄이 다음 되도록 박테리아 조명/유도 반복에 후반 지 수 성장 단계에서 액체 문화 단계를 사용 하 여 pDawn Ag43 박테리아의 클론 식민지를 방식 으로입니다.
마지막으로, 제 4의 중요 한 부분을 철저 하 게, 하지만 또한 부드럽게 씻어 프로토콜; 패턴화 biofilm 후 남은 planktonic 셀은 따라서, PBS와 여러 부드러운 린스 단계를 수행 하는 것이 좋습니다.
셀 패턴5,에 대 한 기존 기술에 비해6, 패턴에 따라 pDawn Ag43 광학 biofilm를 사용 하려면 항목의 합리적으로 낮은 장벽에가지고 소, 깨끗 한 객실 시설, 복잡 한 필요 하지 않습니다. 화학, 또는 표면 전처리, 패턴 제작 기술로 일반적으로 관련 된 높은 해상도 (25 μ m)와 수은 아직. 메서드를 사용 하면 진 식17을 제어 하기 위한 세균성 사진 평판에 대 한 이전 작업을 확장 합니다. 현재, pDawn-Ag43 플라스 미드 복제, pUC 기반 근원 사용 하지만 pDawn와 Ag43는 둘 다 다른 (그람 음성) 세균성 종에 호환 대장균, 제한 됩니다. 유전자 기술 잠재적으로 소개 하는 다른 세균 종 빛 규제 biofilm 형성에 대 한 사용할 수 있으며, 미래 연구에 대 한 가능한 방향을 나타냅니다. 기술은의 또 다른 잠재적인 한계 그것 약한 네이티브 biofilm 형성 (예, MG1655 대장균) 긴장에 biofilm 형성을 증가 시켜 작품 이다. 그러나, 강력한 네이티브 biofilm 형성 된 종자는 제외 패턴된 biofilm 형성 여기; pDawn-Ag43 설명 된 대로 사용 하 여 조명 조건에 biofilms 양식 아직 optogenetic 기술을 여전히 biofilm 형성 조절에 적용 가능한 증명할 수 있습니다. 우리는 다른 문맥에서 biofilm 패터 닝의 대체 방법을 통해 광 c-디-GMP 변조18등, 사용할 수 있습니다는 주의.
전반적으로, pDawn-Ag43 기반 패터 닝 하는 기능1 에 biofilm 구조의 영향을 조사 하 고, 따라서, biofilm 패턴화 가변 제어에서 혜택을 수 있는 응용 프로그램에서 사용 하기 위해 적절 한 될 것입니다-특히 관련 강조 하기 위해 예 biofilms2미생물 생태학의 연구 이다. 미래 방향 패턴된 바이오8,9 또는 구조적된 세균성 지역 사회를 만드는 포함 됩니다. 대체이 액세스할 수 있는 프로토콜의 또한 애플리케이션으로 바이오 아트19, 공식 및 비공식 생명 과학 교육20,,2122뿐만 아니라 분명히 미적 가능성, 주어진 있다. 교육의 관점에서 여기에 설명 된 프로토콜 많은 관련 기술 (세균성 문화, 변환, 광학/optogenetics)를 결합 한 제품 이며 또한 하였으므로 연장 (예를 들어, 마이크로 포함).
The authors have nothing to disclose.
저자는 그들의 도움이 제안 및 그들의 confocal 현미경에 접근을 위한 Spormann 연구소에 대 한 디, H. 김, N. Cira, A. Choksi, S. 라 잔, 유리와 B. 키를 감사합니다. 또한, 저자는 장학, 건강의 국립 연구소 (R21-인공 지능-139941), 그리고 미국 암 협회 (RSG-14-177-01) 스탠포드 바이오 X Bowes NSERC PGS에서 지원을 인정합니다.
DH5alpha/pDawn-Ag43 | Addgene | 107742 | DH5alpha cloning strain hosting pDawn-Ag43 plasmid – plasmid needs to be moved to E. coli strain of interest prior to use |
MG1655 E. coli | Coli Genetic Stock Center – Yale University | CGSC #6300 | MG1655 was used as E. coli strain of interest in this paper's representative results |
RFP expression plasmid | iGEM biobricks | J04450-pSB4K5bb | Many options exist to obtain fluorescent bacteria – if using plasmid, ensure backbone does not conflict with colE1 ori of pDawn-Ag43 |
Plasmid miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
LB broth powder | Affymetrix | 75852 | Add 20 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin to get sterile LB+spec |
LB agar powder | Affymetrix | 75851 | Add 35 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin, pour into petri dishes to get sterile LB+spec plates |
Petri dishes | Fisherbrand | 431760 | |
Spectinomycin hydrochloride pentahydrate | abcam | ab141968 | Make 1000x stock 50mg/mL in water, filter sterilize and dilute into media as needed |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Mix at 1:1 ratio with water, sterilize by autoclave or filter to obtain 50% glycerol |
M63 media salts 5X solution | Bio-world | 705729 | Add cas-amino acids, glucose and MgSO4, bring to 1X salts concentration by adding sterile water |
Casamino acids | Amresco | J851 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.1%) |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.2%) |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Make 1 M stock in water, autoclave and add to M63 as supplement (final concentration 1 mM) |
Crystal violet | Acros organics | 212120250 | Dilute to 0.1% in water prior to use |
Self-hardening mounting media (Shandon immumount) | Thermo Scientific | 9990402 | Use to preserve samples over long term for fluorescence imaging |
Phosphate buffered saline (PBS) solution | Gibco | 10010023 | Can also use PBS prepared from powder / tablets |
6 well plate | Fisherbrand | 351146 | Used as biofilm culture dish for representative results |
PDMS kit | Dow | SYLGARD 184 | Can be used to make enclosed microchamber cavities using soft lithography |
1 mL syringe | BD syringe | 309659 | For use with liquid handling with enclosed microchambers |
Blunt tip needle | CML supply | 901-23-050 | Attaches to 1 mL syringe |
Lab tape | Fisherbrand | 15-901 | Use to attach culture chamber to incubator ceiling |
Bacterial incubator | Sheldon Manufacturing | SMI6 | Ensure interior height of incubator is tall enough to focus projector at the ceiling |
Portable projector | Ivation | IV-PJ-PRO-4-1 | Many portable projector models exist, pDawn-Ag43 has been tested with multiple models including LED/laser based, with blue light channel ranging from 450-460nm central wavelength |
Optical breadboard base | ThorLabs | MSB6 | Base for optical setup to hold projector – many other setups possible, just need to hold projector firmly at bottom of incubator, pointing upwards |
Optical post | ThorLabs | TR8 | 2 posts needed – one to be set up vertically extending out of breadboard base, one horizontally attached via right-angle clamp |
Optical post right-angle clamp | ThorLabs | RA90 | Connects vertical and horizontal posts |
Mounting base | ThorLabs | BA1S | Connects optical breadboard base and vertical post |
1/4"-20 screw | ThorLabs | SH25S050 | Attaches vertical post to mounting base, mounting base to breadboard base |
1/4"-20 set-screw | ThorLabs | SS25E63D | Connects horizontal post to projector via tripod screw-hole |
Optical power meter | Newport | 840 | Use with power meter detector to measure projector illumination intensity – many power meter models exist, using one that has extendable detector will facilitate measurement |
Optical power meter detector | Newport | 818-UV | Connects to power meter (above) – UV detector not strictly necessary as blue light is within visible range |
Adjustable ND filter | K&F Concept | SKU0689 | Adjustable (by rotating) neutral density filter – place above projector aperture |
Presentation-projector software | Microsoft | Powerpoint | Any software that allows drawing / presentation will suffice |
CAD software | Autodesk | AutoCAD | Used for designing photomasks, many mask printing services are compatible with AutoCAD files |
Film photomask | Fineline Imaging | n/a | Many photomask printer services exist for high resolution (>30000DPI) film photomask printing |