Spatio-temporelle contrôlée Translocation nucléaire des invités dans les cellules vivantes à l’aide de colles moléculaires en cage comme des balises Photoactivatable

Published: January 17, 2019

doi:

Rina Mogaki, Kou Okuro, Akio Arisaka, Takuzo Aida²

¹Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering,University of Tokyo, ²Riken Center for Emergent Matter Science

Summary

Ce protocole décrit la translocation nucléaire déclenchée à la lumière des clients dans l’utilisation des balises de “cage” colle moléculaire des cellules vivantes. Cette méthode est prometteuse pour administration de médicaments sélectifs site nucléaire de ciblage.

Abstract

Le noyau de la cellule est l’un des principaux organites comme une cible de délivrance de médicaments subcellulaires, depuis la modulation de la réplication des gènes et expression est efficace pour le traitement de diverses maladies. Ici, nous démontrons la translocation nucléaire déclenchée à la lumière des invités à l’aide de cage tags colle moléculaire (^Cagedcolle-R), dont plusieurs pendentifs ion (Gu⁺) de guanidinium sont protégés par un groupe de photoclivables anionique (butyrate-substitués nitroveratryloxycarbonyl ; ^BA CONV). Invités le tag ^Cagedcolle-R sont absorbées dans la vie des cellules par endocytose et restent dans les endosomes. Toutefois, dès lors, ^Cagedcolle-R est converti en uncaged moléculaire colle (colle-R^Uncaged) transportant plusieurs pendentifs Gu⁺, qui facilite l’évasion endosomal et translocation nucléaire subséquente des invités. Cette méthode est prometteuse pour site sélectif nucléaire ciblage administration de médicaments, puisque les invités marquées peuvent migrer dans le cytoplasme, suivi par le noyau de la cellule uniquement lorsque photoirradiated. ^{Avec cage} Tags de colle-R peuvent livrer macromoléculaires invités tels que boîtes quantiques (QDs) ainsi que de petites molécules hôtes. ^{Avec cage} Étiquettes de colle-R peuvent être uncaged avec non seulement les rayons UV, mais aussi les deux photons proche infrarouge (NIR) lumière qui peut pénétrer profondément dans les tissus.

Introduction

Le noyau de la cellule, qui contient des informations génétiques, est l’un des principaux organites comme une cible de délivrance de médicaments subcellulaires, depuis modulation de la réplication des gènes et expression est efficace pour le traitement de diverses maladies dont le cancer et génétique les troubles de¹^,²^,³. Pour nucléaire livraison de médicaments, conjugaison de peptide balises telles que la localisation nucléaire signaux (NLS)⁴^,⁵^,⁶ a été largement étudiée. Toutefois, afin de réduire les effets secondaires indésirables, contrôle spatio-temporelle de la translocation nucléaire est nécessaire.

Auparavant, lumière déclenchée la translocation des protéines dans le noyau de la cellule a été réalisée à l’aide de “cage” NLS⁷^,⁸^,⁹. NLS migre dans le noyau de la cellule en se liant aux protéines de transport cytoplasmique⁶. Dans les méthodes signalées, protéines de commentaires portant “cage” NLS sont directement incorporés dans le cytoplasme par microinjection⁸ ou exprimées dans les cellules cibles à l’aide d’un code génétique expansion technique⁹. Par conséquent, une méthode qui peut atteindre l’absorption cellulaire et translocation nucléaire photoinduit est avantageuse pour des applications pratiques.

Ici, nous décrivons la translocation nucléaire déclenchée à la lumière des invités dans les cellules vivantes à l’aide de balises dendritiques colle moléculaire en cage (^Cagedcolle-R, Figure 1). Les colles moléculaire solubles dans l’eau¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² ^, ²³ portant plusieurs pendentifs Gu⁺ a été développé, qui adhèrent fermement à protéines¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^, ¹⁶^,¹⁷, acides nucléiques¹⁸^,¹⁹^,²⁰, de membranes phospholipidiques²¹et argile nanofeuillets²²^,²³ à la formation de multiples ponts salins entre leurs pendentifs Gu⁺ et oxyanionic des groupes sur les cibles. Les pendentifs de Gu⁺ du ^Cagedcolle-R sont protégés par un groupe de photoclivables anionique, nitroveratryloxycarbonyl substitués butyrate (conv^BA). Invités le tag ^Cagedcolle-R sont absorbées dans la vie des cellules par endocytose et séjour dans les endosomes (Figure 2). Dès lors, les groupes de conv ^BAdu ^Cagedcolle-R sont détachés pour produire une uncaged moléculaire colle (colle-R^Uncaged) transportant plusieurs pendentifs Gu⁺ , qui facilite ensuite la migration de l’invité étiquetée dans le cytoplasme, suivi par le noyau de la cellule (Figure 2). La balise de colle-R ^Cagedpeut être uncaged par l’exposition aux UV ou deux photons proche infrarouge (NIR) lumière sans phototoxicité grave. Nous démontrons l’administration nucléaire spatio-temporelle controlee de macromoléculaires invités ainsi que des invités de petites molécules avec ^Cagedtags de colle-R, en utilisant des points quantiques (QDs) et un colorant fluorescent (nitrobenzoxadiazole ; NBD), respectivement, à titre d’exemples.

Figure 1 : Structures schématiques ^Cagedcolle-r Les 9 pendentifs ion (Gu⁺) de guanidinium de ^Cagedcolle-R sont protégés par un groupe de nitroveratryloxycarbonyl substitués butyrate (conv^BA). Les groupes de conv ^BAsont clivés par irradiation UV ou lumière NIR deux photons. Le noyau central de ^Cagedcolle-R est fonctionnalisé avec nitrobenzoxadiazole (NBD) ou dibenzocylooctyne (DBCO). Réimprimé avec la permission de référence²⁰. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Illustration schématique de la translocation nucléaire déclenchée à la lumière des invités conjugué avec une balise de colle-R ^Caged. L’invité /^Cagedconjugué de colle-R est absorbé dans la vie des cellules par endocytose. Dès lors, la balise de colle-R ^Cagedest uncaged pour produire une balise de colle-R ^Uncagedqui peut faciliter l’évasion endosomal de l’invité étiquetée. Par la suite, l’invité tagged migre dans le noyau de la cellule. Réimprimé avec la permission de référence²⁰. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Protocol

1. préparation des invités avec cagecolle-R Tags Préparer la solution de colle-NBD Caged. Une synthèse suivant les procédures décrites précédemment20 Cagedcolle-NBD (Figure 1). Préparer une solution de colle Caged-NBD (10 mM) dans le sec diméthylsulfoxyde (DMSO).Note : Stocker la solution dans l’obscurité. La solution peut être diluée avec tampons aqueux ou de milieux de cultu…

Representative Results

Avant photo-irradiation, cellules Hep3B incubées avec Cagedcolle-NBD exposées émission de fluorescence ponctuée de leur intérieur (λext = 488 nm ; Figures 4 a et 4 C, vert). Une micrographie analogue a été obtenue sur l’excitation 543 nm pour le colorant rouge fluorescente (Figures 4 b et 4C, rouge), indiquant que le Cagedcolle-NBD localisée dans les …

Discussion

Les enquêtes précédentes de lumière déclenchée la translocation des protéines dans le noyau de la cellule ont été obtenus à l’aide de “cage” NLS⁷^,⁸^,⁹. Comme mentionné précédemment, ces méthodes nécessitent des techniques supplémentaires pour incorporer les NLS-protéines dans le cytoplasme. En revanche, notre balise de colle-R ^Cagedpermet non seulement translocation nucléaire induite par la photo, m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous reconnaissons le centre pour l’intégration de NanoBio, l’Université de Tokyo. Ce travail a été soutenu par la subvention pour jeunes scientifiques (B) (26810046) à K.O. et partiellement pris en charge par subvention de recherche spécialement favorisé (25000005) à Mr T.A. Merci les bourses de recherche de la société japonaise pour la Promotion of Science (JSPS ) pour les jeunes scientifiques et le programme Leading Graduate Schools (GPLLI).

Materials

Azide-PEG4-NHS ester	Click Chemistry Tools	AZ103
Q-dot 655 ITK	Invitrogen	Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)	NIPPON Genetics	TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)	Harvard Apparatus	7425-RC25K
Hep3B Cells	ATCC	HB-8064
8-chambered glass substrate	Nunc	155411JP
96-well culture plate	Nunc	167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM)	Thermo Fisher Scientific	10370-021
Fetal bovine serum (FBS)	GE Healthcare	SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS)	Wako Pure Chemical Industries	045-29795
LysoTracker Red	Lonza Walkersville	PA-3015
Hoechst 33342	Dojindo	H342
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
Confocal laser scanning microscope	Carl-Zeiss	LSM 510	Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP8
Xenon light source	Asahi Spectra	LAX-102
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax Paradigm

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Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A., Aida, T. Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags. J. Vis. Exp. (143), e58631, doi:10.3791/58631 (2019).