Spatiotemporally नियंत्रित परमाणु Photoactivatable टैग के रूप में बंदी आणविक गोंद का उपयोग कर कोशिकाओं में रहने वाले मेहमानों के Translocation

Published: January 17, 2019

doi:

Rina Mogaki, Kou Okuro, Akio Arisaka, Takuzo Aida²

¹Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering,University of Tokyo, ²Riken Center for Emergent Matter Science

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन प्रकाश में मेहमानों के जीवित ट्रिगर परमाणु translocation का उपयोग कर कोशिकाओं को बंदी आणविक गोंद टैग । इस विधि साइट के लिए वादा कर रहा है-चयनात्मक परमाणु लक्ष्यीकरण दवा वितरण ।

Abstract

कोशिका नाभिक एक उपसेलुलर दवा वितरण लक्ष्य के रूप में सबसे महत्वपूर्ण organelles में से एक है, जीन प्रतिकृति और अभिव्यक्ति के मॉडुलन के बाद से विभिन्न रोगों के इलाज के लिए प्रभावी है । यहां, हम प्रदर्शन प्रकाश का उपयोग कर मेहमानों के परमाणु translocation को बंदी बनाकर आणविक गोंद (^{पिंजरा}गोंद-आर) टैग, जिसका एकाधिक guanidinium आयन (गुजरात⁺) पेंडेंट एक anionic photocleavable समूह द्वारा संरक्षित है (butyrate-प्रतिस्थापित nitroveratryloxycarbonyl; ^BA NVOC) । मेहमानों के साथ टैग की गईं पिंजरा गोंद आर endocytosis के माध्यम से जीवित कोशिकाओं में ले रहे है और endosomes में रहते हैं । हालांकि, photoirradiation पर, ^{पिंजरा}गोंद आर uncage आणविक गोंद में परिवर्तित (पिंजरा गोंद-आर) एकाधिक गुजरात⁺पेंडेंट, जो endosomal भागने और मेहमानों के बाद परमाणु translocation की सुविधा ले जा रहा है । इस विधि साइट चयनात्मक परमाणु लक्ष्यीकरण दवा वितरण के लिए वादा किया है, क्योंकि टैग मेहमानों कोशिका द्रव्य में सेल नाभिक द्वारा पीछा किया ही जब photoirradiated में स्थानांतरित कर सकते हैं । ^{पिंजरा} लगाया गोंद-R टैग macromolecular मेहमानों जैसे क्वांटम डॉट्स (QDs) और साथ ही छोटे अणु मेहमानों को वितरित कर सकते हैं । ^{पिंजरा} लगाया गोंद आर टैग न केवल यूवी प्रकाश, लेकिन यह भी दो फोटॉन के पास अवरक्त (NIR) प्रकाश है, जो गहराई से ऊतक में घुसना कर सकते है के साथ अनबंदी किया जा सकता है ।

Introduction

कोशिका नाभिक, जो आनुवंशिक जानकारी वहन करती है, एक सेलुलर दवा वितरण लक्ष्य के रूप में सबसे महत्वपूर्ण organelles में से एक है, जीन प्रतिकृति और अभिव्यक्ति के मॉडुलन के बाद से कैंसर और आनुवंशिक सहित विभिन्न रोगों के इलाज के लिए प्रभावी है विकारों¹^,²^,³. दवाओं के परमाणु वितरण के लिए, परमाणु स्थानीयकरण संकेतों (एनएलएस)⁴^,⁵^,⁶ के रूप में पेप्टाइड टैग की विकार व्यापक रूप से जांच की गई है । हालांकि, अवांछित दुष्प्रभावों को कम करने के लिए, परमाणु translocation के spatiotemporal नियंत्रण आवश्यक है ।

पहले, सेल नाभिक में प्रोटीन के प्रकाश ट्रिगर translocation एनएलएस⁷^,⁸^,⁹बंदी का उपयोग कर प्राप्त किया गया है । एनएलएस सेल नाभिक में cytoplasmic परिवहन प्रोटीन⁶के लिए बाध्य द्वारा विस्थापित । रिपोर्ट के तरीके में, अतिथि प्रोटीन असर बंदी एनएलएस सीधे microinjection द्वारा कोशिका द्रव्य में शामिल कर रहे है⁸ या लक्ष्य कोशिकाओं में व्यक्त की एक आनुवंशिक कोड विस्तार तकनीक⁹का उपयोग कर । इसलिए, एक तरीका है कि दोनों सेलुलर और फोटो प्रेरित परमाणु translocation प्राप्त कर सकते है व्यावहारिक अनुप्रयोगों के लिए लाभप्रद है ।

इस के साथ साथ, हम प्रकाश का वर्णन वृक्ष बंदी आणविक गोंद (^{पिंजरे}में गोंद-R, चित्रा 1) टैग का उपयोग कर कोशिकाओं में रहने वाले मेहमानों के परमाणु translocation ट्रिगर । पानी में घुलनशील आणविक गोंद¹⁰^,^11,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² ^, ²³ असर एकाधिक गुजरात⁺ पेंडेंट पहले विकसित किया गया है, जो कसकर प्रोटीन का पालन¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴,¹⁵^, ¹⁶^,¹⁷, न्यूक्लिक एसिड¹⁸,¹⁹^,²⁰, फॉस्फोलिपिड झिल्ली²¹, और क्ले nanosheets²²^,²³ के माध्यम से लक्ष्य पर अपने गुजरात⁺ पेंडेंट और oxyanionic समूहों के बीच कई नमक पुलों का गठन । गुजरात⁺ पिंजरा गोंद के पेंडेंट-R एक anionic photocleavable समूह, butyrate-प्रतिस्थापित nitroveratryloxycarbonyl (^BANVOC) द्वारा संरक्षित कर रहे हैं । मेहमानों के साथ टैग की गईं पिंजरा गोंद आर endocytosis के माध्यम से जीवित कोशिकाओं में ले रहे है और endosomes (चित्रा 2) में रहते हैं । photoirradiation पर, ^बापिंजरा गोंद के NVOC समूहों-r एक uncage में आणविक गोंद (पिंजरा गोंद-आर)एकाधिक गुजरात⁺ पेंडेंट, जो तो टैग अतिथि के प्रवास की सुविधा को लेकर उपज को अलग कर रहे है सेल नाभिक (चित्रा 2) द्वारा पीछा कोशिका द्रव्य में । ^{पिंजरा}गोंद आर टैग यूवी या दो गंभीर phototoxicity के बिना अवरक्त (NIR) प्रकाश के लिए जोखिम से uncageed जा सकता है । हम macromolecular मेहमानों के spatiotemporally नियंत्रित परमाणु वितरण के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में पिंजरा गोंद आर टैग के साथ छोटे अणु मेहमानों का प्रदर्शन, क्वांटम डॉट्स (QDs) और एक फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग कर (nitrobenzoxadiazole; NBD), क्रमशः उदाहरण के रूप में ।

चित्रा 1: पिंजरा गोंद के योजनाबद्ध संरचनाओं आर । पिंजरा गोंद के 9 guanidinium आयन (गुजरात⁺) पेंडेंट-R एक butyrate-स्थानापन्न nitroveratryloxycarbonyl (^BANVOC) समूह द्वारा संरक्षित हैं. ^बीएNVOC समूहों यूवी या दो फोटॉन NIR प्रकाश के साथ विकिरण से सट रहे हैं । ^बंदीगोंद के फोकल कोर-R या तो nitrobenzoxadiazole (NBD) या dibenzocylooctyne (DBCO) के साथ कार्यात्मक है । संदर्भ²⁰से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्रा 2: प्रकाश के योजनाबद्ध चित्रण-मेहमानों संयुग्मित के एक पिंजरा गोंद आर टैग के साथ परमाणु translocation ट्रिगर । अतिथि/^{पिंजरा}गोंद-R संयुग्मी endocytosis के माध्यम से जीवित कोशिकाओं में ले लिया है । photoirradiation पर, ^{पिंजरा}गोंद आर टैग के लिए एक uncage में गोंद-r टैग, जो टैग अतिथि के endosomal भागने की सुविधा कर सकते है uncage में है । इसके बाद, टैग किए गए अतिथि कक्ष नाभिक में माइग्रेट होता है । संदर्भ²⁰से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Protocol

1. पिंजरा गोंद के साथ मेहमानों की तैयारी-R टैग पिंजरागोंद-NBD समाधान तैयार करें । संश्लेषित गोंद-NBD (चित्रा 1) पहले20वर्णित प्रक्रियाओं के बाद । सूखी dimethyl sulfoxide (DMSO ) …

Representative Results

photoirradiation से पहले, पिंजरा गोंद के साथ Hep3B कोशिकाओं NBD उनके इंटीरियर से कबरा प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का प्रदर्शन किया (λext = ४८८ एनएम; आंकड़े 4a और 4c, हरा) । एक अनुरूप micrograph उत्तेजना ?…

Discussion

सेल नाभिक में प्रकाश ट्रिगर प्रोटीन की translocation के पिछले जांच के पिंजरा एनएलएस⁷^,⁸^,⁹का उपयोग कर प्राप्त किया गया है । जैसा कि पहले उल्लेख किया है, इन तरीकों अतिरिक्त तकनीक क?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम NanoBio एकीकरण, टोक्यो विश्वविद्यालय के लिए केंद्र स्वीकार करते हैं । यह काम अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था युवा वैज्ञानिकों के लिए सहायता (ख) (२६८१००४६) K.O. करने के लिए और आंशिक रूप से अनुदान द्वारा समर्थित विशेष रूप से पदोन्नत अनुसंधान के लिए सहायता (२५०००००५) T.A. R.M. धन्यवाद विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान समाज के अनुसंधान फैलोशिप (JSPS ) युवा वैज्ञानिकों और अग्रणी स्नातक स्कूलों (GPLLI) के लिए कार्यक्रम के लिए ।

Materials

Azide-PEG4-NHS ester	Click Chemistry Tools	AZ103
Q-dot 655 ITK	Invitrogen	Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)	NIPPON Genetics	TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)	Harvard Apparatus	7425-RC25K
Hep3B Cells	ATCC	HB-8064
8-chambered glass substrate	Nunc	155411JP
96-well culture plate	Nunc	167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM)	Thermo Fisher Scientific	10370-021
Fetal bovine serum (FBS)	GE Healthcare	SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS)	Wako Pure Chemical Industries	045-29795
LysoTracker Red	Lonza Walkersville	PA-3015
Hoechst 33342	Dojindo	H342
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
Confocal laser scanning microscope	Carl-Zeiss	LSM 510	Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP8
Xenon light source	Asahi Spectra	LAX-102
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax Paradigm

References

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Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A., Aida, T. Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags. J. Vis. Exp. (143), e58631, doi:10.3791/58631 (2019).