Summary

הקמתה של הומניזציה Dual-TK-חעוגה מודל העכבר עבור הנגיף הקשור HIV פתוגנזה

Published: September 11, 2019
doi:

Summary

פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה להקמת עכברים הומניזציה עם מערכת החיסון האנושית ותאי הכבד. השני עכברים לקויה מחדש השיגה באמצעות הזרקה התוך הטחול של האדם hepatocytes ו CD34+ תאי גזע המטרופאיות רגישים לנגיף הכשל החיסוני האנושי-1 זיהום ונזק הכבד לכידה כפי שנצפתה ב . חולים נגועים באיידס

Abstract

למרות תוחלת החיים המוגבר של חולים נגועים בנגיף הכשל החיסוני האנושי-1 (HIV-1), מחלת הכבד התפתחה כגורם נפוץ של התחלואה שלהם. הכבד immunopathology הנגרמת על ידי HIV-1 נשאר חמקמק. מודלים בעלי חיים קטנים של השתלה עם המעי האנושי ומערכת החיסון האנושית יכולים ללכוד את הביולוגיה האנושית של הפתוגנזה של המחלה. בזאת, פרוטוקול מתואר כדי להקים מודל הומניסטי כפול העכבר באמצעות האדם hepatocytes ו CD34+ המטפאות גזע/מחולל קדמון תאים (HSPCs) השתלת, כדי ללמוד הכבד immunopathology כפי שנצפתה בחולים נגועים באיידס. כדי להשיג החוקה הכפולה, זכר TK-חעוגה (נוד. Cg-prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg (Alb-TK) 7-2/ShiJic) עכברים הם intraperitoneally וזרק עם ganciclovir (gcv) מינונים כדי לחסל את תאי הכבד טרנסגניים העכבר, עם treosulfan עבור מיזוג nonmyeloablative, שניהם להקל על מערכת החיסון האנושית של המערכת החיסונית (שלו). רמות אלבומין האנושי (ALB) מוערכות עבור מינון הכבד, והנוכחות של תאי החיסון האנושיים בדם שאותרו על ידי הזרימה cy, try מאשרת את הקמתה של המערכת החיסונית האנושית. המודל פיתח באמצעות פרוטוקול המתואר כאן דומה רכיבים מרובים של נזק לכבד מזיהום HIV-1. הקמתה יכולה להוכיח להיות חיוני למחקרים של דלקת וירוס הפטיטיס ושיתוף הערכה של תרופות אנטי ויראליות ואנטי.

Introduction

מאז הופעתו של טיפול תרופתי, יש כבר ירידה משמעותית במקרי מוות הקשורים HIV-1 monoinfection. עם זאת, מחלת כבד התפתחה כגורם נפוץ של תחלואה בחולים נגועים ב-HIV1,2. זיהומים הפטיטיס של וירוסי צהבת עם hiv-1 זיהום נפוצים יותר, חשבונאות עבור 10%-30% של אנשים נגועים באיידס בארצות הברית3,4,5.

המארח-ספציפיות של HIV-1 ווירוסים צהבת מגביל את השירות של מודלים בעלי חיים קטנים כדי ללמוד מחלות זיהומיות אדם ספציפי או לחקור היבטים מרובים של הפתוגנזה הקשורים בכבד HIV-1. עכברים לקויה המאפשרים את החרט של תאים אנושיים ו/או רקמות (כינה מודלים של עכברים הומניזציה) הם מודלים בעלי חיים מקובלים עבור מחקרים קדם-קליניים6,7,8. מאז המבוא של עכברים הומניזציה בתחילת שנות האלפיים, מחקרים פרה-קליניים מרובים של רעילות הכבד האנושי, פתוגנים אנושיים, כולל HIV-1 ו-HIV הקשורים הפרעות נוירוקוגניטיביות, וירוס אפשטיין בר, צהבת, ועוד מחלות זיהומיות, נחקרו אלה עכברים6,9,10,11. מודלים של עכבר מרובים עבור CD34+ hspcs ו/או השתלת hepatocyte האדם כבר זמן רב פותחו ושופרו לאורך זמן כדי ללמוד את הפתוגנזה המחלה של הפטיטיס B וירוס (hbv)-הקשורים מחלת הכבד12, מיכל בן 13 , 14. מספר דגמים עבור hspc ו hepatocyte האדם (הפטיטיס) השתלת מבוססים על זנים, המכונה חעוגה (נוד. Cg-prkdcscid Il2rgtm1Sug/jictac)8,13, nsg (הנהון. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj)15, balb/C-Rag2 γc-/- (Rag2tm 1.1 flv Il2rgtm 1.1 flv/j)12, ו-פה-/- הנהון rag1-/- il2rγnull העכבר16. עם זאת, לכל דגם יש יתרונות ומגבלות משלו; לדוגמה, AFC8 עכברים כפולים הומניזציה עבור HEPs ותאי גזע האדם (HSCs) ב Balb/C-Rag2 γc-/- רקע מאפשר את החרט המוצלח של תאים חיסוניים ו HSCs, אבל יש העדר של אנטיגן ספציפי T-ו-B-cell תגובה במודל12זה. החששות העיקריים במרכיבי עכברים הומניזציה כפולה כוללים בתאום מחדש, חוסר מודלים מתאימים לתמוך ברקמות שונות, תנאים לא תואמים, דחייה החיסונית, או השתל-מול-מארחים מחלה (gvhd), וטכני קשיים, כגון מניפולציות מסוכן עם ילודים ושיעורי תמותה גבוהים בשל חריגות מטבולית13.

למרות עכברים הומניזציה שימשו למחקר HIV במשך שנים רבות17,18,19, השימוש של עכברים הומניזציה ללמוד נזק לכבד שנגרם על ידי HIV-1 כבר מוגבל20. בעבר דיווחו על הקמתה של הומניזציה כפולה TK-חעוגה מודל העכבר ויישומו במחלת הכבד הקשורים ל-HIV8. מודל זה מראה את החרט החסון של הכבד ואת התאים החיסוניים ולכידה הפתוגנזה זיהום HIV. דיון זה מציג פרוטוקול מפורט, כולל הצעדים הקריטיים ביותר בהשתלה של הפטוציטים אנושיים. תיאור של HSPCs נדרש העפיל מוצלחת של HEPs והקמת מערכת חיסונית תפקודית ב-TK-חעוגה עכברים מוצגים גם. השימוש בעכברים אלה כדי ללמוד immunopathogenesis הכבד הקשורים לאיידס מפורט. TK-חעוגה עכברים זכרים נושאים את הכבד הספציפי הרפס וירוס סוג 1 תימידין קינאז (HSV-TK) טרנסגנטית משמשים. כדוריות הכבד של העכבר ביטוי זה יכול בקלות להיות בלתי מבוקר לאחר חשיפה קצרה למינון רעיל של GCV. תאים המושתלים בכבד האדם נשמרים באופן בלתי נשכח בתוך הכבד של העכבר ללא תרופות אקסוגני21. העכברים הם גם ממוזג עם מינונים nonmyeloablative של treosulfan ליצור נישה במח העצם העכבר עבור תאים אנושיים8. חעוגה לקויה-הזרקת טי-טי-טי. העכברים מנוטרים לאחר מכן באופן סדיר עבור מחדש דם והכבד החוקה על ידי immunophenotyping קלדה ומדידות של סרום ברמות אנושיות-אלבומין, בהתאמה. עכברים עם חוקה מוצלחת של יותר מ 15% עבור תאי החיסון האנושיים ו-HEPs הם intraperitoneally וזרק עם HIV-1. ההשפעה של HIV על הכבד ניתן להעריך מוקדם ככל 4-5 שבועות לאחר ההדבקה. חשוב לציין כי בגלל HIV-1 נעשה שימוש, כל אמצעי הזהירות הדרושים יש לנקוט בעת טיפול בווירוס והזרקת אותו לתוך עכברים.

Protocol

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) במרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה. הערה: קבל אישור IACUC המקומי לפני ביצוע ניסויים על בעלי חיים. 1. עיבוד דם חבל הטבור ובידוד האדם העברי בצע את כל השלבים של הפרוטוקול תחת תנאים סטריליים ב…

Representative Results

הקמתה של מודל עכבר כפול הומניזציה עם הכבד האנושי ותאים חיסוניים ניתן לפקח בקלות בכל שלב עם אליסה פשוטה מאוד וזרימה cy, בהתאמה. Cy, הזרמת הזרימה מבוצעת באופן קבוע כדי להעריך את ההתפתחות של מערכת חיסונית תפקודית לראות את ההשפעה של זיהום HIV על התאים החיסוניים. ב עכברים הומניזצי…

Discussion

הכבד הוא נפרץ וניזוק בחולים נגועים באיידס24. ניסיוני מודלים בעלי חיים קטנים לחקר מחלות הכבד האנושי בנוכחות HIV-1 הוא מוגבל מאוד, למרות הזמינות של כמה מודלים בעלי חיים המושתלים עם CD34+ hspcs ו hepatocytes7,12, . עשרים וחמש בניסויים מחו?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי למענק הבריאות R24OD018546 (כדי L.Y.P. ו S.G.). המחברים רוצים להודות Weizhe Li, Ph.D., לעזרה בהליכים כירורגי, אמנדה סניף וודס, בולשיט, יאן צ’נג עבור אימונוהיסטולוגיה, UNMC זרימה cytometry מתקן מחקר חברי המנהל פיליפ הקסלי, Ph.D., ויקטוריה ב. סמית, בולשיט, וסמנתה וול, בולשיט, UNMC מתקדמים הליבה המיקרוסקופיה חברי מתקנים ג’ניס א. טיילור, בולשיט, וג ר. טלסקה, בולשיט, על התמיכה הטכנית. המחברים מכירים בד”ר. מורו איטו והירושי סואמאז מ-CIEA למתן העכברים TK-חעוגה ו ד ר יואכים באומגארט למתן טראוסולפן. המחברים מודים לד ר אדריאן קואסטרים, UNMC, על תרומת המאמר שלה לכתב היד.

Materials

27G1/2" needles BD biosciences 305109
30G1/2" needles BD biosciences 305106
5 mL polystyrene  round-bottom tube 12 x 75 mm style Corning 352054
BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle BD biosciences 309659
BD FACS array bioanalyzer  BD Biosciences For purity check of eluted CD34+ cells 
BD FACS array software BD Biosciences Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array
BD FACS lysing solution BD Biosciences 349202 To lyse red blood cells
BD LSR II BD Biosciences Instrument for acquisiton of flow cytometry samples
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube BD biosciences BD 367874 To collect Cord blood
Bovine Serum Albumin  Sigma-aldrich A9576
Buprenorphine Controlled substance and pain-killer
CD14-PE BD Biosciences 555398 Specific to human
CD19-BV605 BD Biosciences 562653 Specific to human
CD34 MicroBead Kit, human Miltenyi Biotec 130-046-702 For isoation of   CD34+ HSPC
CD34-PE, human Miltenyi Biotec 130-081-002 Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells 
CD3-AF700 BD Biosciences 557943 Specific to human
CD45-PerCPCy5.5 BD Biosciences 564105 Specific to human
CD4-APC BD Biosciences 555349 Specific to human
CD8-BV421 BD Biosciences 562428 Specific to human
Cell counting slides Bio-rad 1450015
ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit Thermofisher scientific CS11204 for extraction of genomic DNA from ear piece
Cobas Amplicor system v1.5  Roche Molecular Diagnostics bioanalyzer to measure viral load
Cotton-tipped applicators   McKesson 24-106-2S
Cytokeratin-18 (CK18) DAKO M7010 Specific to human
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma-aldrich D2650-5X5ML
Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile BD biosciences 30914 Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion
FACS Diva version 6 BD Biosciences flow cytometer software required for  acqusition of sample
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10438026
FLOWJO analysis software
v10.2
FLOWJO, LLC flow cytometry analysis software
Ganciclovir APP Pharmaceuticals, Inc. 315110 Prescripition drug
Greiner MiniCollect EDTA Tubes Greiner bio-one 450475
Hepatocytes thawing medium  Triangle Research Labs  MCHT50
Horizon Open Ligating Clip Appliers Teleflex 537061 To hold the ligating clips
Hospira Sterile Water for Injection ACE surgical supply co. Inc. 001-1187 For dilution of Buprenorphine (pain-killer)
Human Albumin ELISA Quantitation Set Bethyl laboratories E80-129 For assesing human albumin levels in mouse serum
Human hepatocyte Triangle Research Labs  HUCP1  Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified 
Iris Scissors, Straight Ted Pella, Inc. 13295
Lancet MEDIpoint Goldenrod 5 mm
LS columns  Miltenyi Biotec 130-042-401 Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection)
Lymphocyte Separation Medium (LSM) MP Biomedicals 50494 For isoation of   lymphocytes from peripheral blood
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 holds Qudro MACS seperator and LS columns
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument Co. RS-5605 Used to make an incision on skin to expose spleen
Micro Dissecting Forceps Roboz Surgical Instrument Co. RS-5157  to hold and pull out spleen from peritoneal cavity
mouse CD45-FITC BD Biosciences 553080 mouse-specific
PBS (Phosphate Buffered Saline) Hyclone SH30256.02
Qudro MACS separator  Miltenyi Biotec 130-090-976 holds four LS columns
RPMI 1640 medium Gibco 11875093
StepOne Plus Real Time PCR  Applied Biosystems Instrument used  to  genotype
Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml DYMAX CORP T15469 Used to  dispense  HSPC and HEP supension in controlled manner
Suturevet PGA synthetic absorbale suture Henry Schein Animal Health 41178 Suturing of skin and peritoneum
TaqMan Gene Expression Master Mix Thermofisher scientific 4369016
TC20 automated cell counter Bio-rad 1450102
TK-NOG mice  Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu)
Treosulfan Medac GmbH Provided by  Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) 
Trypan Blue Bio-rad 1450022
Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L Ted Pella, Inc. 1346 Used to make an incision on skin to expose spleen
Weck hemoclip traditional titanium ligating clips Esutures 523700 To ligate the spleen post-injection

References

  1. Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).
  2. Puoti, M., et al. Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).
  3. Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection. The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).
  4. Scharschmidt, B. F., et al. Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival. Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).
  5. Lacombe, K., Rockstroh, J. HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges. Gut. 61, 47-58 (2012).
  6. Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
  7. Billerbeck, E., et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells. The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).
  8. Dagur, R. S., et al. Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice. Biology Open. 7 (2), (2018).
  9. Gaska, J. M., Ploss, A. Study of viral pathogenesis in humanized mice. Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).
  10. Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders. Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).
  11. Xu, D., et al. Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).
  12. Washburn, M. L., et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease. Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).
  13. Gutti, T. L., et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice. The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).
  14. Strick-Marchand, H., et al. A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes. PLoS One. 10 (3), 0119820 (2015).
  15. Keng, C. T., et al. Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection. Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).
  16. Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).
  17. Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. . Humanized Mice for HIV Research. , (2014).
  18. Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy. Frontiers in Immunology. 9, 817 (2018).
  19. Zhang, L., Su, L. HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).
  20. Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model. The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).
  21. Hasegawa, M., et al. The reconstituted ‘humanized liver’ in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).
  22. Higuchi, Y., et al. The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice. Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).
  23. Kosaka, K., et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).
  24. Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. Human immunodeficiency virus infection and the liver. World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).
  25. Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, 120-124 (2013).
  26. Kong, L., et al. Low-level HIV infection of hepatocytes. Virology Journal. 9, 1-7 (2012).
  27. Dash, P. K., et al. Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice. AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).
  28. Sun, S., Li, J. Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).
  29. Shafritz, D. A., Oertel, M. Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).
  30. Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).
  31. Streetz, K. L., et al. Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells. Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).

Play Video

Cite This Article
Dagur, R. S., Wang, W., Makarov, E., Sun, Y., Poluektova, L. Y. Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis. J. Vis. Exp. (151), e58645, doi:10.3791/58645 (2019).

View Video