qKAT: Quantitative sulla tipizzazione di assassino-cellula immunoglobulina-come geni del ricevitore

Summary

Quantitativa delle cellule di assassino immunoglobulina-come recettore (KIR) semi-automatica digitando (qKAT) sono un metodo semplice, ad alta velocità e costi contenuto per copiare il numeri geni KIR di tipo per la loro applicazione negli studi di associazione di popolazione e la malattia.

Abstract

Recettori di immunoglobulina-come delle cellule killer (KIRs) sono un insieme di ricevitori immuni inibitori e d’attivazione, il natural killer (NK) e le cellule di T, codificate da un cluster polimorfico di geni sul cromosoma 19. Loro ligandi meglio caratterizzate sono le molecole (HLA) l’antigene umano del leucocita che sono codificate all’interno il locus di istocompatibilità complex (MHC) sul cromosoma 6. Vi sono prove concrete che giocano un ruolo significativo nell’immunità, riproduzione e trapianto, rendendo fondamentale avere tecniche che possono misurare con precisione il genotipo li. Tuttavia, alta omologia, anche come allelica e variazione numero di copia, rendono difficile al genotipo ed efficientemente i metodi di progettazione che possono misurare con precisione tutti i geni KIR . Metodi tradizionali sono solitamente limitati nella risoluzione dei dati ottenuti, velocità effettiva, rapporto costo-efficacia e il tempo impiegato per l’impostazione e l’esecuzione degli esperimenti. Descriviamo un metodo chiamato quantitativa KIR semi-automatico digitando (qKAT), che è un metodo di reazione a catena multipla della polimerasi in tempo reale di alto-rendimento che può determinare i numeri di copia del gene per tutti i geni del locus di KIR . qKAT è un semplice metodo di alto-rendimento che può fornire dati ad alta risoluzione KIR copia numeri, che possono essere ulteriormente utilizzati per dedurre le variazioni negli aplotipi strutturalmente polimorfici che li comprendono. Questi dati di numero e aplotipo di copia possono essere utili per gli studi su associazioni di malattia su larga scala, genetica delle popolazioni, nonché indagini sull’espressione e interazioni funzionali tra KIR e HLA.

Introduction

In esseri umani, il recettore immunoglobulina-come assassino(KIR) locus è mappato sul braccio lungo del cromosoma 19 all’interno del complesso recettoriale del leucocita (LRC). Questo locus è circa 150 kb di lunghezza e comprende 15 KIR geni disposti testa-coda. I loci KIR che sono attualmente noti sono KIR2DL1, KIR2DL2/ KIR2DL4,KIR2DL3, KIR3DL1, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5/KIR3DS1, KIR3DL2-3, e due pseudogeni, KIR2DP1 e KIR3DP1. I geni KIR codificano per bidimensionale (2D) e tridimensionali (3D) immunoglobulina-come dominio recettori con breve (S; attivazione) o lungo (L; inibitorio) Code citoplasmatiche che sono espresse da cellule natural killer (NK) e sottoinsiemi di T cellule. Copia numero variazione esposte all’interno delle forme di locus KIR diversi aplotipi con gene variabile contenuto¹. La ricombinazione omologa non allelica (NAHR), facilitata da una composizione di gene di testa-coda stretta e alta-omologia, è il meccanismo proposto per essere responsabili della variabilità hanno. Oltre 100 diversi aplotipi sono stati segnalati in popolazioni in tutto il mondo^1,2,3,4. Tutti questi aplotipi potrebbero essere diviso in due gruppi principali: gli aplotipi di A e B. L’aplotipo A contiene 7 geni KIR : KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1e KIR3DL2, che sono inibitori KIR geni e l’attivazione KIR gene KIR2DS4. Tuttavia, fino al 70% degli individui di origine europea che sono omozigotici per KIR aplotipo A esclusivamente trasportare una forma non funzionale “eliminazione” di KIR2DS4^5,6. Tutte le altre combinazioni di geni KIR formano aplotipi di gruppo B, tra cui almeno uno dei geni KIR specifici KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, e KIR2DL5e in genere includono due o più geni KIR d’attivazione.

Molecole HLA di classe I sono stati identificati come i ligandi per determinati recettori inibitori (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3e KIR3DL1), attivando i recettori (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5e KIR3DS1), e per KIR2DL4, che è un unico KIR che contiene un citoplasmico lunghe code come altri recettori inibitori KIR, ma ha anche un residuo di caricato positiva vicino il dominio extracellulare che è un comune caratteristica di altri recettori KIR d’attivazione. La combinazione di varianti all’interno dei geni KIR e i geni HLA influenza interazione ligando del recettore che reattività potenziali forme NK cella al livello individuale^7,8. La prova dagli studi di associazione genetica ha indicato che KIR svolge un ruolo nella resistenza virale (ad es.., virus dell’immunodeficienza umana [HIV]⁹ ed epatite C [HCV] virus¹⁰), il successo del trapianto ¹¹, il rischio di gravidanza disturbi e successo riproduttivo^12,13, la protezione contro la ricaduta dopo trapianto ematopoietico allogeneic della cellula formativa (HSCT) trapianto^{14,15, 16}e il rischio di cancri¹⁷.

La combinazione di alta-omologia e allelica e hanno diversità presenta sfide nel compito di accuratamente geni KIR di genotipizzazione. I metodi convenzionali di geni KIR tipo comprendono primer sequenza-specifici (SSP) polimerasi reazione a catena (PCR)^18,19,20, oligonucleotide sequenza-specific sonda (SSOP) PCR²¹, e aghi laser assistita desorbimento ionizzazione-tempo di volo spettrometria di massa (MALDI-TOF MS)²². Gli svantaggi di queste tecniche sono che essi forniscono solo parziale spaccato il genotipo di un individuo pur essendo anche laborioso da eseguire. Recentemente il sequenziamento di nuova generazione (NGS) è stata applicata per digitare il locus KIR specificamente. Mentre questo metodo è molto potente, può essere costoso per l’esecuzione, ed è tempo di effettuazione di verifiche approfondite analisi e dati.

qKAT è un metodo PCR quantitativo ad alta produttività. Mentre i metodi convenzionali sono laboriosa e che richiede tempo, questo metodo rende possibile eseguire quasi 1.000 campioni di DNA (gDNA) genomici in cinque giorni e dà il genotipo KIR , così come il numero di copie del gene. qKAT è costituito da dieci reazioni multiplex, ciascuno dei quali destinato a due KIR loci e copia di un gene di riferimento di un numero fisso copia nel genoma (STAT6) utilizzato per la relativa quantificazione del gene di KIR numero²³. Questo test è stato utilizzato con successo negli studi che coinvolgono la popolazione grandi pannelli e coorti di malattia malattie infettive come HCV, patologie autoimmuni come il diabete di tipo 1, e disturbi della gravidanza come la preeclampsia, così come fornire una genetica alla base di studi volti a comprendere le NK cell funzione^1,4,24,25,26.

Protocol

1. preparazione e placcatura fuori dal DNA Quantificare con precisione la concentrazione gDNA utilizzando uno strumento spettrofotometrico o fluorometrica. Diluire il DNA a 4 ng / µ l su una piastra a 96 pozzetti profondi pozzetti. Includere almeno un controllo gDNA campione con un numero di copia nota e un modello di non controllo. Centrifugare le piastre da 96 pozzetti a 450 x g per 2 min. Utilizzando uno strumento di gestione dei liquidi, dispensare ogni campione in quadruplice copia sulle piastre 384 pozzetti qPCR affinché ogni pozzo ha 10 ng di DNA (2,5 µ l/pozzetto). Preparare almeno dieci piastre da 384 pozzetti, uno per ciascuna reazione di qKAT. Se gDNA è erogato da più di una piastra a 96 pozzetti, eseguire un lavaggio di intero volume con 2% candeggina e acqua ultrapura per pulire gli aghi del liquido sistema tra ogni piastra a 96 pozzetti dei campioni gDNA manipolazione. Asciugare il DNA incubando le piastre da 384 pozzetti in un’area pulita a temperatura ambiente per almeno 24 h. 2. preparazione del primer e sonde Nota: qKAT è costituito da dieci reazioni multiplex. Ogni reazione comprende tre coppie di primer e tre sonde fluorescenza-etichetta che amplificano in particolare due geni KIR e gene di un riferimento. Le sonde che sono state pubblicate in Jiang et al.27 sono state modificate affinché i oligonucleotides ora sono contrassegnati con le tinture ATTO poiché offrono una migliorata fotostabilità e segnale deve percorrere lunghe durate. Primer pre-aliquotato combinazioni sono disponibili in commercio (Vedi Tabella materiali). Preparare le combinazioni di primer per ogni reazione secondo le diluizioni riportati nella tabella 1. Preparare la sonda combinazioni per ogni reazione secondo la tabella 1. Ogni sonda individuo prima di effettuare la combinazione di prova. 3. preparazione della Master Mix Nota I volumi di seguito indicati sono per l’esecuzione di uno qKAT reazione su un set di piastre da 10 x 384 pozzetti. Assicurarsi che i campioni di gDNA placcati sulle piastre da 384 pozzetti siano completamente asciutti. Eseguire tutti i passaggi su ghiaccio e mantenere i reagenti coperti dall’esposizione alla luce per quanto possibile, dal momento che le sonde fluorescenza-labeled sono foto – e termo-sensibili. Sbrinare il buffer di qPCR, primer e aliquote di sonda a 4 ° C. Su ghiaccio, preparare un mix master per 10 x 384 pozzetti aggiungendo 18,86 mL di acqua ultrapura, 20 mL di buffer di qPCR, 1.000 µ l di combinazione preprepared primer e 180 µ l di combinazione preprepared sonda (tabella 2). Distribuire uniformemente il mix master su un piatto ben 96-profondo utilizzando una pipetta multicanale, pipettaggio 415 µ l in ogni pozzetto. Mantenere questo piatto in una scatola di ghiaccio coperta dalla luce. Utilizzando uno strumento di gestione dei liquidi, dispensare 9,5 µ l di mix master in ciascun pozzetto della piastra 384 pozzetti con gDNA secco. Sigillare la piastra con un foglio e mettere immediatamente a 4 ° C. Ripetere questo processo per le piastre rimanenti, assicurando che gli aghi del liquido sistema di movimentazione vengono lavati con acqua tra ogni piatto. Centrifugare le piastre da 384 pozzetti a 450 x g per 3 min e li Incubare a 4 ° C durante la notte o tra 6-12 h per risospendere il DNA e dissipare eventuali bolle d’aria. 4. qPCR Assay Dopo l’incubazione overnight, centrifugare a 450 x g per 3 min dissipare eventuali bolle d’aria rimanente. Ai fini dell’automazione, connettere la macchina qPCR (ad es., LightCycler 480) a un gestore di micropiastre (Vedi Tabella materiali). Programma per il gestore di micropiastre per inserire le piastre della macchina di qPCR da un bacino di stoccaggio refrigerato che è protetto dalla luce.Nota i saggi dovrebbero, in teoria, funzionare su altre macchine di qPCR con impostazioni ottiche compatibili. Utilizzare le seguenti condizioni in bicicletta: 95 ° C per 5 min, seguiti da 40 cicli di 95 ° C per 15 s e 66 ° C per 50 s, con raccolta di dati a 66 ° C. Una volta che viene completata l’esecuzione, è necessario avere il robot raccogliere la piastra dalla macchina qPCR e inserirlo nel dock scartare. 5. post-esecuzione analisi Dopo l’amplificazione, calcolare i valori di ciclo (Cq) quantificazione utilizzando il secondo metodo di massimo derivato o il metodo di punti di adattamento con il software della macchina qPCR (Vedi Tabella materiali), procedi nel seguente modo. Aprire il software di qPCR e, nella scheda Navigator , aprire il file di esperimento di reazione salvato per una piastra. Per l’analisi utilizzando il secondo metodo di massimo derivato, selezionare la scheda di analisi e create una nuova analisi utilizzando il metodo Abs Quant/Second derivato Max. Nella finestra Crea nuova analisi , selezionare il tipo di analisi: metodo Abs Quant/Second derivato Max, sottoinsieme: tutti i campioni, programma: amplificazione, nome: Rx-DFO (dove x è il numero di reazione). Selezionare Filtro pettine e scegliere VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Ciò assicura che i dati raccolti per STAT6 sono selezionati. Selezionare compensazione del colore per VIC/HEX/Yellow555(533-580). Fare clic su Calcola. Ripetere questa operazione per Fam (465-510) e Cy5/Cy5.5(618-660). Fare clic su Salva file. Per l’analisi mediante il metodo di punti di adattamento, selezionare Abs Quant/Fit punti nella scheda analisi. Nella finestra Crea nuova analisi , selezionare il tipo di analisi: metodo Abs Quant/Fit punti, sottoinsieme: tutti i campioni, programma: amplificazione, nome: RxF-DFO (dove x è il numero di reazione). Selezionare i filtri corretti e compensazioni di colore per STAT6 e ciascuno dei geni KIR (Fam/Cy5). Nella scheda Noiseband , impostare la banda di rumore per escludere il rumore di fondo. Nella scheda analisi , impostare i punti di adattamento a 3 e selezionare che Visualizza i punti di adattamento. Fare clic su Calcola. Fare clic su Salva file. 6. esportazione dei risultati Nel software qPCR, aprire il navigatore scheda selezionare Risultati Batch Export. Aprire la cartella in cui i file di esperimento sono salvati e trasferire i file nella sezione destra della finestra. Fare clic su Avanti. Selezionare il nome e il percorso del file di esportazione. Selezionare il tipo di analisi Metodo Max di derivato Quant/Second Abs o Abs Quant/Fit punti. Fare clic su Avanti. Verifica che il nome del file, la cartella di esportazione e il tipo di analisi siano corretto e fare clic su Next per avviare il processo di esportazione. Attendere che lo Stato di esportazione è Ok. Lo schermo passa automaticamente alla fase successiva. Verifica che tutti i file selezionati sono stati esportati con successo affinché il numero di file non riusciti = 0. Fare clic su fatto. Utilizzare gli script split_file.pl e roche2sds.pl per dividere le piastre esportate in reazioni individuali per ogni piatto.Nota gli script sono disponibili su richiesta/GitHub. 7. copiare il numero di calcoli Aprire il software di analisi numero copie (ad esempio, CopyCaller). Selezionare Importa file di risultati PCR in tempo reale e caricare file di testo creati da roche2sds.pl. Seleziona analizza e condurre l’analisi sia selezionando campione calibratore con numero di copia nota oppure selezionando numero di copia più frequente. Vedere tabella 5 per il numero più frequente di copia dei geni KIR in genere osservata in popolazioni di origine europea. 8. qualità dei dati controlla Utilizzare script di R KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R per combinare dati di numero di copia da tutti i piatti in un foglio di calcolo.Nota gli script sono disponibili su richiesta/GitHub. Ricontrollare i dati grezzi sul software di analisi numero di copia per i campioni non conformi per il noto squilibrio (LD) per geni KIR (tabella 6).

Representative Results

Copia numero analisi possono essere effettuata esportando i file per il software di analisi numero copie, che fornisce il numero di copie previsto e stimato sulla base del metodo ΔΔCq. Il numero di copia può essere previsto in base al numero di copia nota di campioni di DNA di controllo sulla piastra o inserendo il numero di copia del gene più frequente (tabella 5). La figura 1 Mostra i risultati di una piastra per una reazione che gli obiettivi di KIR2DL4 e KIR3DS1, come pure il gene di riferimento STAT6. Il numero di copia più frequente per KIR2DL4, un gene di quadro in luogo del KIR , è due copie, mentre il numero più frequente di copia per KIR3DS1, un gene d’attivazione, è una copia. I risultati in figura mostrano le trame di amplificazione di PCR osservate sul software qPCR e i dati di numero di copia generati dai dati qPCR. Come illustrato, il dosaggio è in grado di distinguere tra 0, 1, 2, 3 e 4 numeri di copia del gene KIR . Il software di analisi numero di copia consente inoltre una visualizzazione della distribuzione del numero di copia tutta la piastra come un grafico a torta o un grafico a barre. L’efficacia della previsione del numero di copia è inferiore per i campioni con un numero superiore di copia. La qualità di tutti i materiali utilizzati nelle reazioni, gDNA, buffer, primer le sonde, può influenzare la precisione dei risultati ottenuti. Tuttavia, la discordanza nei risultati è più probabile essere causato a causa di variazione della concentrazione di DNA attraverso un piatto. La purezza del gDNA Estratto, che può essere misurata usando il 260/280 e 260/230 rapporti, può anche avere un effetto sulla qualità. Un rapporto di 260/280 di 1.8-2 e un 260/230 rapporto di 2-2.2 sono desiderabili. Una concentrazioni di gamma irregolare di DNA attraverso un piatto possono portare a un’alta variabilità del ciclo di soglia (Ct) tra campioni e discordanza nella gamma del numero stimato di copia. I risultati in Figura 2 mostrano l’effetto che la disparità tra i valori dit C attraverso un piatto può avere sulla precisione nella previsione del numero di copia. La linea rossa indica l’intervallo del numero stimato di copia per un campione e, idealmente, dovrebbe essere più vicino al valore integer come possibile. I dati di numero di copia, una volta analizzati, possono essere esportati come un file di foglio di calcolo in un formato a 96 pozzetti. Abbiamo utilizzato uno script di R (disponibile su richiesta) per combinare i dati di numero di copia di tutti i 10 piatti che vengono eseguiti come un set in un foglio di calcolo. Dati pubblicati circa KIRs da popolazioni di origine europea principalmente consentono la previsione di regole di LD che esiste tra vari geni nel complesso KIR 1. Queste previsioni sono utilizzate per condurre controlli a valle sui copia numeri risultati ottenuti (tabella 6). Campioni non conformi per il LD previsto fra i geni potrebbero contenere polimorfismo insolito o hanno variazioni strutturali. Un diagramma di flusso che descrive il protocollo è illustrato nella Figura 3. Uno strumento chiamato KIR aplotipo identificatore (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) è stato sviluppato per facilitare l’imputazione di aplotipi dal set di dati. L’imputazione lavora sulla base di un elenco di riferimento aplotipi osservati in una popolazione di origine europea1. Tuttavia, lo strumento permette anche per un set personalizzato di aplotipi di riferimento deve essere utilizzato invece. Vengono generati tre file distinti; il primo file elenca tutte le combinazioni di aplotipo per un campione, il secondo file viene fornito un elenco rifilato le combinazioni di aplotipi che hanno le più alte frequenze combinate e il terzo file elenca i campioni che non possono essere assegnati gli aplotipi. Non-assegnazione degli aplotipi potrebbe essere utilizzato come un indicatore del romanzo aplotipi. Figura 1: numero di risultati rappresentativi di una piastra per reazione 5. (A) Questa amplificazione spettacoli pannello trame. (B), questo pannello spettacoli copiare Numero trame. (C), questo pannello mostra la distribuzione del numero di copia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: risultati rappresentativi di una piastra con una concentrazione variabile di DNA per reazione numero 5. (A) Questa amplificazione spettacoli pannello trame. (B), questo pannello spettacoli copiare Numero trame. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: diagramma di flusso del protocollo qKAT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Analisi Geni Forward primer Concentrazione (nM) Iniettori d’inversione Concentrazione (nM) Sonde Concentrazione (nM) N. 1 3DP1 A4F 250 A5R 250 P4a 150 2DL 2 2DL2F4 400 C3R2 600 P5B 150 STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150 N. 2 2DS2 A4F 400 A6R 400 P4a 200 2DL 3 D1F 400 D1R 400 P9 150 STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150 N. 3 3DL 3 A8F 500 A8R 500 P4a 150 2DS4Del 2DS4Del 250 2DS4R2 250 P5B 150 STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150 N. 4 3DL1e4 B1F 250 B1R 125 P4b 150 3DL1e9 D4F 250 D4R2 500 P9 150 STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150 N. 5 3DS1 B2F 250 B1R 250 P4b 150 2DL 4 C1F 200 C1R 200 P5B – 2DL 4 150 STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150 N. 6 2DL 1 B3F 500 B3R 125 P4b 150 2DP1 D3F 250 D3R 500 P9 150 STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150 N. 7 2DS1 B4F 500 B4R 250 P4b 150 2DL 5 D2F 500 D2R 500 P9 150 STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150 N. 8 2DS3 B5F 250 B5R 250 P4b 150 3DL2e9 D4F 250 D5R 125 P9 150 STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150 N. 9 3DL2e4 A1F 200 A1R 200 P4a 150 2DS4FL 2DS4FL 250 2DS4R2 500 P5B 150 STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150 N. 10 2DS5 B6F2 200 B6R3 200 P4b 150 2DS4 C5F 250 C5R 250 P5B 150 STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150 Tabella 1: combinazione e concentrazione di primer e sonde utilizzate in ogni reazione di qKAT 27 . Reazione Aliquote di primer (µ l) Sonda di aliquote (µ l) R1 3DP1 A4F A5R 2DL2F4 C3R2 ACQUA STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6 2DL 2 100 100 160 240 200 80 80 60 60 60 R2 2DS2 A2F A6R D1F D1R ACQUA STAT6F STAT6R P4A P9 PSTAT6 2DL 3 160 160 160 160 160 80 80 80 60 60 Nota: è necessario 20 µ l meno acqua nel MasterMix R3 3DL 3 A8F A8FB A8R 2DS4DELF 2DS4R2 ACQUA STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6 2DS4DEL 100 100 200 100 100 200 80 80 60 60 60 R4 3DL1E4 B1F B1R D4F D4R2 ACQUA STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6 3DL1E9 100 50 100 200 350 80 80 60 60 60 R5 3DS1 B2F B1R C1F C1R ACQUA STAT6F STAT6R P4B P5B – 2L 4 PSTAT6 2DL 4 100 100 80 80 440 80 80 60 60 60 R6 2DL 1 B3F B3R D3F D3R ACQUA STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6 2DP1 200 50 100 200 250 80 80 60 60 60 R7 2DS1 B4F B4R D2F D2R ACQUA STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6 2DL 5 200 100 200 200 100 80 80 60 60 60 R8 2DS3 B5F B5R D4F D5R ACQUA STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6 3DL2E9 100 100 100 50 450 80 80 60 60 60 R9 3DL2E4 A1F A1R 2DS4WTF 2DS4R2 ACQUA STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6 2DS4WT 80 80 100 200 340 80 80 60 60 60 R10 2DS5 B6F2 B6R3 C5F C5R ACQUA STAT6F STAT6R P4B P5B PSTAT6 2DS4TOTAL 80 80 100 100 440 80 80 60 60 60 Tabella 2: Soluzioni per rendere primer e sonde aliquote di combinazione di riserva di volume (µ l) di 100 µM primer/sonda. Nome Direzione modifica a 5 minuti 3 ´ modifica Sequenza (5′ →3′) Lunghezza TM GC % Esone Posizione P4a Senso FAM BHQ-1 TCATCCTGCAATGTTGGTCAGATGTCA 27 60 44,4 4 425-451 P4b Antisenso FAM BHQ-1 AACAGAACCGTAGCATCTGTAGGTCCCT 28 62 50 4 576-603 P5B Senso ATTO647N BHQ-2 AACATTCCAGGCCGACTTTCCTCTG 25 60 52 5 828-852 P5B – 2DL 4 Senso ATTO647N BHQ-2 AACATTCCAGGCCGACTTCCCTCTG 25 61 56 5 828-852 P9 Senso ATTO647N BHQ-2 CCCTTCTCAGAGGCCCAAGACACC 24 60 62,5 9 1246-1269 PSTAT6 ATTO550 BHQ-2 CTGATTCCTCCATGAGCATGCAGCTT 26 62 50 Tabella 3: elenco delle sonde utilizzate in qKAT 1, 27. i coloranti fluorescenti utilizzati all’estremità 5′ delle sonde oligo P5b, P5b – 2 DL 4, P9 e PSTAT6 sono stati modificati per ATTO coloranti. Gene Primer Direzione Sequenza (a 5 minuti-3 ´) Lunghezza TM GC % Esone Posizione Amplicon (bp) Alleli potrebbero essere perso 3DL2e4 A1F Avanti GCCCCTGCTGAAATCAGG 18 52 61,1 4 399-416 179 3DL 2 * 008, * 021, * 027, * 038. A1R Invertire CTGCAAGGACAGGCATCAA 19 53 52,6 559-577 3DL 2 * 048 3DP1 A4F Avanti GTCCCCTGGTGAAATCAGA 19 49 52,6 4 398-416 112 Nessuno A5R Invertire GTGAGGCGCAAAGTGTCA 18 52 55,6 492-509 Nessuno 2DS2 A2F Avanti GTCGCCTGGTGAAATCAGA 19 49 52,6 4 398-416 111 Nessuno A6R Invertire TGAGGTGCAAAGTGTCCTTAT 21 51 42,9 488-508 Nessuno 3DL 3 A8Fa Avanti GTGAAATCGGGAGAGACG 18 50 55,6 4 406-423 139 Nessuno A8Fb Avanti GGTGAAATCAGGAGAGACG 19 50 52,6 405-423 3DL 3 * 054, 3DL 3 * 00905. A8R Invertire AGTTGACCTGGGAACCCG 18 51 61,1 526-543 Nessuno 3DL1e4 B1F Avanti CATCGGTCCCATGATGCT 18 51 55,6 4 549-566 85 3DL 1 * 00505, 3DL 1 * 006, 3DL 1 * 054, 3DL 1 * 086, 3DL 1 * 089 B1R Invertire GGGAGCTGACAACTGATAGG 20 52 55 614-633 3DL 1 * 00502 3DS1 B2F Avanti CATCGGTTCCATGATGCG 18 51 55,6 4 549-566 85 3DS1 * 047; può prendere 3DL 1 * 054. B1R Invertire GGGAGCTGACAACTGATAGG 20 52 55 614-633 Nessuno 2DL 1 B3F Avanti TTCTCCATCAGTCGCATGAC 20 52 50 4 544-563 96 2DL 1 * 020, 2DL 1 * 028 B3R Invertire GTCACTGGGAGCTGACAC 18 50 61,1 622-639 2DL 1 * 023, 2DL 1 * 029, 2DL 1 * 030 2DS1 B4F Avanti TCTCCATCAGTCGCATGAA 19 51 47,4 4 545-563 96 2DS1 * 001 B4R Invertire GGTCACTGGGAGCTGAC 17 49 64,7 624-640 Nessuno 2DS3 B5F Avanti CTCCATCGGTCGCATGAG 18 53 61,1 4 546-563 96 Nessuno B5R Invertire GGGTCACTGGGAGCTGAA 18 51 61,1 624-641 Nessuno 2DS5 B6F2 Avanti AGAGAGGGGACGTTTAACC 19 50 52,6 4 475-493 173 Nessuno B6R3 Invertire TCCAGAGGGTCACTGGGC 18 53 66,7 630-647 2DS5 * 003 2DL 4 C1F Avanti GCAGTGCCCAGCATCAAT 18 52 55,6 5 808-825 83 Nessuno C1R Invertire CCGAAGCATCTGTAGGTCT 19 52 52,6 872-890 2DL 4 * 018, 2DL 4 * 019 2DL 2 2DL2F4 Avanti GAGGTGGAGGCCCATGAAT 19 52 57,9 5 778-796 151 2DL 2 * 009; 782G cambiato A. C3R2 Invertire TCGAGTTTGACCACTCGTAT 20 51 45 909-928 Nessuno 2DS4 C5F Avanti TCCCTGCAGTGCGCAGC 17 57 70,6 5 803-819 120 Nessuno C5R Invertire TTGACCACTCGTAGGGAGC 19 52 57,9 904-922 2DS4 * 013 2DS4Del 2DS4Del Avanti CCTTGTCCTGCAGCTCCAT 19 54 57,9 5 750-768 203 Nessuno 2DS4R2 Invertire TGACGGAAACAAGCAGTGGA 20 53 50 933-952 Nessuno 2DS4FL 2DS4FL Avanti CCGGAGCTCCTATGACATG 19 53 57,9 5 744-762 209 Nessuno 2DS4R2 Invertire TGACGGAAACAAGCAGTGGA 20 53 50 933-952 Nessuno 2DL 3 D1F Avanti AGACCCTCAGGAGGTGA 17 48 58,8 9 1180-1196 156 Nessuno D1R Invertire CAGGAGACAACTTTGGATCA 20 50 45 1316-1335 2DL 3 * 010, 2DL 3 * 017, 2DL 3 * 01801 e 2DL 3 * 01802 2DL 5 D2F Avanti CACTGCGTTTTCACACAGAC 20 52 50 9 1214-1233 120 2DL5B * 011 e 2DL5B * 020 D2R Invertire GGCAGGAGACAATGATCTT 19 49 47,4 1315-1333 Nessuno 2DP1 D3F Avanti CCTCAGGAGGTGACATACGT 20 53 55 9 1184-1203 121 Nessuno D3R Invertire TTGGAAGTTCCGTGTACACT 20 50 45 1285-1304 Nessuno 3DL1e9 D4F Avanti CACAGTTGGATCACTGCGT 19 52 52,6 9 1203-1221 93 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 068 D4R2 Invertire CCGTGTACAAGATGGTATCTGTA 23 53 43,5 1273-1295 3DL 1 * 05901, 3DL 1 * 05902, 3DL 1 * 060, 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 064, 3DL 1 * 065, 3DL 1 * 094N, 3DL 1 * 098 3DL2e9 D4F Avanti CACAGTTGGATCACTGCGT 19 52 52,6 9 1203-1221 156 Nessuno D5R Invertire GACCTGACTGTGGTGCTCG 19 54 63,2 1340-1358 Nessuno STAT6 STAT6F Avanti CCAGATGCCTACCATGGTGC 20 54 60 129 STAT6R Invertire CCATCTGCACAGACCACTCC 20 54 60 Tabella 4: sequenze dei primer utilizzati in qKAT 1, 27. KIR gene 3DL 3 2DS2 2DL 2 2DL 3 2DP1 2DL 1 3DP1 2DL 4 3DL 1EX9 3DL 1EX9 3DS1 2DL 5 2DS3 2DS5 2DS1 2DS4Totale 2DS4FL 2DS4DEL 3DL 2EX4 3DL 2EX9 Più frequente numero di copia 2 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 2 1 1 2 2 Tabella 5: Più frequente numero di copie per KIR geni comunemente osservati in campioni di origine europea. Linkage disequilibrium regole per qKAT basato su popolazioni europee Controllo del numero di copia 1 KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 e KIR3DL2 sono quadro geni presenti su entrambi gli aplotipi. KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 e KIR3DL2 = 2 2 KIR2DS2 e KIR2DL2 sono in LD con a vicenda 2DS2=2 DL 2 3 KIR2DL2 e KIR2DL3 sono alleli dello stesso gene 2 DL 2+2 DL 3= 2 4 KIR2DP1 e KIR2DL1 sono in LD con a vicenda 2DP1=2 DL 1 5 Esone 4 di KIR3DL1 e KIR3DL2 è uguale a essone 9 di KIR3DL1 e KIR3DL2 rispettivamente. 3DL1ex4=3DL1ex9 e 3DL2ex4=3DL2ex9 6 KIR3DL1 e KIR3DS1 sono alleli 3 DL 1+3DS1= 2 7 KIR2DS3 e KIR2DS5 sono in LD con KIR2DL5 2DS3+2DS5=2 DL 5 8 KIR3DS1 e KIR2DS1 sono in LD 3DS1=2DS1 9 Presenza di KIR2DS1 e KIR2DS4Total è mutualmente esclusivo su un aplotipo 2DS1+2DS4TOTAL= 2 10 KIR2DS4FL e KIR2DS4del sono varianti del KIR2DS4TOTAL 2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL Tabella 6: Linkage disequilibrium tra KIR geni comunemente osservati nelle popolazioni di origine europea possono essere utilizzati per controllare i dati di numero di copia 1,27.

Discussion

Abbiamo descritto un nuovo metodo semi-automatico ad alta velocità, chiamato qKAT, che facilita la copia numero digitando dei geni KIR . Il metodo rappresenta un miglioramento rispetto ai metodi convenzionali come SSP-PCR, che sono basso-throughput e possono solo indicare la presenza o l’assenza di questi geni altamente polimorfici.

La precisione dei dati numeri copia ottenuti dipende da molteplici fattori, tra cui la qualità e la concentrazione-uniformità dei campioni gDNA e la qualità dei reagenti. La qualità e la precisione dei campioni gDNA attraverso un piatto sono estremamente importanti poiché variazioni nella concentrazione su tutta la piastra possono causare errori nel calcolo del numero della copia. Poiché i dosaggi sono stati convalidati utilizzando set di campioni di origine europea, dati dalle coorti da altre parti del mondo richiedono controlli più approfonditi. Questo è per garantire che le istanze di allele dropout o associazione non specifici primer/sonda non sono interpretati erroneamente come variazione numero di copia.

Mentre i dosaggi sono stati progettati e ottimizzati per l’esecuzione come ad alta velocità, possono essere modificati per eseguire meno campioni. La metrica di fiducia nel software di analisi numero di copia è interessata quando si analizzano campioni di meno, ma questo può essere migliorato se campioni di DNA genomici di controllo con un numero di copia del gene KIR noto sono inclusi sulla piastra e repliche di esempio aggiuntivi sono incluso.

Per i laboratori senza liquido/piastra-manipolazione robot, mix master può essere distribuito utilizzando pipette multicanale e piastre possono essere caricati manualmente nello strumento qPCR.

Lo scopo principale dietro lo sviluppo di qKAT era di creare un semplice, ad alta velocità, alta risoluzione e conveniente metodo per genotipo KIRs per malattia gli studi di associazione. Questo è stato raggiunto con successo poiché qKAT è stato impiegato nell’investigare il ruolo di KIR in parecchi studi di associazione di grande malattia, compreso una gamma di malattie infettive, malattie autoimmuni e gravidanza disturbi^{4, 24 , 25 , 26}.

Materials

REAGENTS
Oligonucleotides	Sigma	Custom order	SEQUENCES: Listed in Table 4
Probes labelled with ATTO dyes	Sigma	Custom order	SEQUENCES: Listed in Table 3
SensiFAST Probe No-ROX Kit	Bioline	BIO-86020	−
MilliQ water	−	−	−
NAME	COMPANY	CATALOG NUMBER	COMMENTS
EQUIPMENT
Centrifuge with a swinging bucket rotor	Eppendorf(or equivalent)	Eppendorf 5810R or equivalent system
NanoDrop	Thermo Scientific	ND-2000
OR
QuBit Fluorometer	Life Technologies	Q33216
Matrix Hydra	Thermo Scientific	109611
LightCycler 480 II Instrument 384-well	Roche	05015243001
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour)	Caliper Life Sciences	204135
Vortex mixer	Biosan	BS-010201-AAA
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL)	Gilson(or equivalent)	F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL)	Starlab (or equivalent)	S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL	STARLAB	E2310-1010
50 mL Centrifuge Tube	STARLAB	E1450-0200
96-well deep well plate	Fisher Scientific	12194162
LC480 384 Multi-well plates	Roche	04729749001
LightCycler 480 Sealing Foil	Roche	04729757001
NAME	COMPANY	CATALOG NUMBER	COMMENTS
SOFTWARE
Roche LightCycler 480 Software v1.5
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1			https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
KIR haplotype identifier			http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/