Isolere, sekvensering og analysere ekstracellulære MicroRNAs fra menneskelige stamceller
Summary
Denne protokollen demonstrerer hvordan å rense ekstracellulære microRNAs fra celle kultur medier for små RNA biblioteket konstruksjon og neste generasjons sekvensering. Ulike kvalitetskontroll sjekkpunkter er beskrevet å tillate leserne å forstå hva du kan forvente når du arbeider med lav input prøver som exRNAs.
Abstract
Ekstracellulære og sirkulerende RNAs (exRNA) er produsert av mange celletyper i kroppen og finnes i mange kroppsvæsker som spytt, plasma, serum, melk og urin. Et delsett av disse RNAs er posttranscriptional regulatorer-microRNAs (miRNAs). For å avgrense miRNAs produsert av spesifikke celletyper, i vitro kultur systemer kan brukes til å høste og profil exRNAs avledet fra en gruppe celler. Secreted faktorene av mesenchymal stamceller er innblandet i å lindre mange sykdommer og brukes som i vitro modell systemet her. Dette dokumentet beskriver prosessen med samling, rensing av små RNA og biblioteket generasjon sekvens ekstracellulære miRNAs. ExRNAs fra kultur medier avvike fra mobilnettet RNA ved å være lav RNA innspill prøvene, som krever optimal prosedyrer. Denne protokollen gir en omfattende guide til små exRNA sekvenser fra kultur medier, viser kvalitetskontroll sjekkpunkter på hvert trinn exRNA rensing og sekvenser.
Introduction
Ekstracellulære og sirkulerer RNAs (exRNAs) er i diverse kroppsvæsker og er motstandsdyktig mot RNases1,2. Deres høy overflod, stabilitet og brukervennlighet tilgjengelighet er attraktive for klinisk vurdering som diagnostiske og prognostiske markører3. Transportmiddelet for exRNAs inkluderer ekstracellulære blemmer (EVs), tilknytning lipoproteiner (for eksempel high-density lipoprotein; HDL) og ribonucleoprotein komplekser (som med Argonaute2 komplekser)4.
Et delsett av exRNAs er microRNAs (miRNAs), som er små ikke-koding RNAs av ca 22 nt som regulerer posttranscriptional genuttrykk. Ex-miRNAs har vært innblandet i celle-celle kommunikasjon og regulering av cellen homeostase5. For eksempel HDL leverer ex-miR-223 til endotelceller å undertrykke intercellulær adhesjon molekyl 1 (ICAM-1) og betennelse6. Interessant, er miR-223 også sett transporteres av ekstracellulære blemmer fra leukocytter til lungekreft cellene, programmering dem til å ta på en mer invasiv fenotypen7. Dermed vil transcriptome av ex-miRNAs fra ulike kroppsvæsker og celle kultur medium forbedre vår forståelse av ex-miRNA signalering.
Liten RNA sekvensering (liten RNA seq) er et kraftig verktøy som kan brukes til å forstå transcriptomics av små RNAs. Ikke bare kan forskjellige prøver sammenlignes blant ulikt uttrykt kjent RNAs, men romanen små RNAs kan også oppdages og preget. Derfor er det også en robust metode å identifisere ulikt uttrykt miRNAs under ulike forhold. En av hindrene av små RNA seq er imidlertid vanskeligheten i å generere små RNA seq biblioteker fra lav exRNA input væsker som cerebrospinal væsker, spytt, urin, melk, serum og kultur medier. TruSeq liten RNA biblioteket Prep protokollen fra Illumina krever ca 1 µg av høy kvalitet totalt og NEBNext liten RNA biblioteket Prep angi protokollen fra New England Biolabs krever 100 ng-1 µg RNA8,9. Ofte, totalt RNA fra disse prøvene er under gjenkjenning grensen for konvensjonelle UV-vis Spektrofotometrene.
Ex-miRNAs fra kroppsvæsker er potensielt gode diagnostiske og prognostiske markører. Men for å studere funksjonelle effektene eller fastslå opprinnelsen til bestemte ex-miRNAs, celle kultur systemer blir ofte brukt i stedet. Stamceller (MSCs) har blitt studert grundig fordi deres EVs har vært innblandet i lindre mange sykdommer, inkludert hjerteinfarkt, Alzheimers sykdom og graft versus host sykdom10. Her viser vi rensing av ex-miRNAs fra Ben margtransplantasjon-avledet MSCs (BMSCs) og fremgangsmåten brukes til å optimalisere liten RNA biblioteket konstruksjon, sekvensering og dataanalyse (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en protokoll for neste generasjons sekvensering av exRNAs som muliggjør differensial uttrykk analyser fra lav input prøver. Følge en bestemt protokoll for EV og exRNA isolasjon er viktig fordi selv små endringer (dvs. ultracentrifugation trinnet eller en endring i rotoren type) kan påvirke transcriptome og miRNA nivå13,14. Dermed uansett hvor exRNA er isolert, er det viktig å bruke samme eksperimentelle og bioinformatic fremgangsmåte på …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige til Mr. Claus buss og Ms. Rita Rosendahl på iNANO for deres kundestøtte. Spesiell takk til Dr. Daniel Otzen for at vår hyppig bruk av hans ultracentrifuge. Denne studien ble støttet av Innovation fondet Danmark (MØNSTRE prosjekt).
Materials
| Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells | ATCC | PCS-500-012 | Cells used in this protocol was bought from ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media) |
| Exosome-depleted FBS | Gibco | A2720801 | |
| ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Flask | Sarstedt | 833,912 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 806552 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor used here | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| β-glycerophosphate | Calbiochem | 35675 | Components of the osteogenic differentiation media |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-25MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | Components of the osteogenic differentiation media |
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma | D1530-1MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA and total RNA purification kit for step 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Library quantification kit used here |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Small RNA library prepartion kit used in this protocol – used in step 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR purification in step 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Trimming low-quality reads in step 6 | |
| cutadapt | Adaptor removal in step 6 | ||
| Bowtie | Mapping of clean reads in step 6 | ||
| Samtools | To make the expression profile in step 6 | ||
| Bedtools | To make the expression profile in step 6 |
References
- Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).
- Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8 (9), e75184 (2013).
- Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs – an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
- Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3 (7), (2018).
- Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).
- Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292 (2014).
- Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).
- . TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018)
- . NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018)
- Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).
- Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells – current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), (2015).
- Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
- Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).
- Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498 (2016).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).
