シグナリング蛋白質の廃止、炎症性腸病気のマウスモデルで腸の炎症に味の効果
Summary
味覚関連遺伝子の無効のデキストラン硫酸ナトリウム (DSS) の免疫反応に及ぼす影響を調査するためのプロトコルの紹介-炎症性腸疾患 (IBD) マウス モデルを誘発します。
Abstract
炎症性腸疾患 (IBD) は、潰瘍性大腸炎、クローン病、世界中の人々 の何百万人の生活の質に影響を与えるなど、免疫関連消化器疾患のひとつです。IBD の症状は腹痛, 下痢, と直腸出血を含む腸内細菌、食品成分、腸上皮細胞と免疫細胞間の相互作用から生じる。各キー遺伝子の腸上皮性および免疫細胞で発現が大腸の炎症をどのように影響するかを評価するために特に重要なのです。G タンパク質共役型味覚受容体は、G タンパク質サブユニット α-gustducin と他のシグナル伝達タンパク質を含むは、腸の中に発見されています。ここでは、代表として α-gustducin を使用、デキストラン硫酸ナトリウム (DSS) を記述-IBD 腸管粘膜免疫と炎症の味覚遺伝子の突然変異の効果を評価するモデルを誘発。このメソッドでは、化学的に誘導される IBD モデル遺伝子ノックアウト技術を組み合わせたもの、したがって味覚遺伝子が無効になるだけでなく、可能性があります exuberate またはコロンの DSS 誘発性免疫応答を抑制する他の遺伝子の結果を評価するために適用できます。変異マウスにより管理される DSS の体重や便、直腸出血が監視され、記録される中に、一定の期間。管理中に異なる縦長で一部のマウスは安楽死させて、サイズとコロン、脾臓の重量を測定し、腸組織を収集し、処理組織学的および遺伝子発現解析。データは過度の体重減少、下痢、腸出血、組織の損傷、炎症と野生型マウスの α gustducin ノックアウト結果を示します。誘発した炎症の重症度はいるマウス系統、住環境、食生活の影響、パイロット実験における DSS 濃度と投与期間の最適化は特に重要です。これらの要因を調整して、両方のアンチと炎症の影響を評価するためにこのメソッドを適用できます。
Introduction
潰瘍性大腸炎 (UC)、クローン病 (CD)、炎症性腸疾患 (IBD) の 2 つの主要な形式は多元的病因1,2 腸の弛張熱または進行性慢性炎症性条件によって特徴付けられます。.IBD の発達は遺伝的と同様、ある特定の環境要因食事療法、抗生物質の使用などに依存し、重要なは、病原性の感染症。しかし、病因と IBD の制御分子機構はまだ明らかではありません。したがって、多数の化学物質誘発 IBD 動物モデルが構築され適用された病因と規制メカニズムを表し、治療学3の有効性を評価します。
好みの受容器が G タンパク質共役受容体 (Gpcr) と 2 つの主要な種類に分類されます: タイプ I (T1Rs)、およびタイプ II (T2Rs) うま味、甘くて苦い化合物を検出します。味シグナル伝達カスケードは、G タンパク質 α gustducin と Gβγ の二量体で構成される、Gβγ のサブユニットのリリースにつながる T1Rs または、ヘテロ三量体のアクティブ化 T2Rs に伝達バインドによって開始されます。Gβγ 部分は、下流のエフェクター酵素ホスホリパーゼ C-β 2 (PLC β 2) を順番に刺激し。活性化 PLC β 2 が 2 つの細胞内二次メッセンジャー [イノシトール-1,4,5-三リン酸 (IP3) とジアシルグリセ ロール] に IP3バインド ホスファチジルイノシトール-4, 5-ビスリン酸を加水分解し、そのチャネル受容体 IP3 を開くR3、小胞体からのカルシウム イオンを放出します。これは最終的に一時的な受容器の潜在的なイオン チャネル Trpm5 の開口部と、味覚神経4,5,6,7に神経伝達物質 ATP の放出に します。まだ、塩辛い、酸っぱい味のシグナル伝達経路は、うま味、甘くて苦い味8から独立して別です。さらに、味 Gpcr のコンポーネントと下流蛋白質が様々 な口腔外組織に存在します。最近の研究では、その α gustducin を示されている、味がシグナル伝達の主成分が腸粘膜で表されることがわかった。シグナリングの口腔外組織9,10のコンポーネントこれらの好みの機能を理解するためにさらなる研究が必要です。
ここで説明したメソッドを使用して、口腔外組織で表される味覚シグナル伝達タンパク質の機能を特徴付けるため。味蕾化学物質誘発大腸炎モデルにおけるシグナル伝達カスケードの輪郭を描くために開発されたトランスジェニック マウスの線を組み合わせています。主に手続き型のシンプルさ、人間の潰瘍性大腸炎に病理組織学的類似性のため、デキストラン硫酸ナトリウム (DSS)-誘導の IBD モデルは様々 な化学物質誘発大腸炎モデル11本のうち最も広く使用されています。本研究で我々 は 1) 組織形態学的変化を分析し、2) の式の違いを試金によって腸粘膜免疫と炎症 α gustducin の新たな機能を明らかにするのに代表的なマウス線として α-gustducin-欠損マウスを使用大腸の炎症に関連するサイトカイン。このメソッドを使用して、遺伝子組み換えマウス ラインの遺伝子と量的そして質的を決定組織の損傷および腸の炎症に味覚シグナル蛋白 (および他のタンパク質が腸内で表現) の貢献できます。興味があります。この方法の利点は、化学の DSS の両方のアクションおよび興味の遺伝子の欠損の結果として統合されたデータを取得するユーザーを有効にします。このメソッドは、その感度を上げる、細胞・分子レベルで腸内の微妙な変化を明らかにするためさらに改善できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このメソッドは、曲率を用いることができる IBD の DSS 誘発マウス モデルにおける炎症の特定の味覚遺伝子の突然変異の効果を決定します。フル活用するには、IBD の最適な誘導は重要なステップです。大腸炎の開発はマウス緊張、住環境、腸内細菌叢、興味の遺伝子などいくつかの要因の影響を受けます。少数の異なる投与量をテストするマウスと DSS 投与期間パイロット実験を実行するこ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、Siyuan 財団、国家自然科学基金、中国の (81671016、31471008、および 31661143030)、国立衛生研究所 (DC010012、DC015819) からの助成金によって支えられています。
Materials
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. | ||
References
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