آثار الذوق مما يشير إلى إلغاء البروتين على التهاب الأمعاء في طراز ماوس مرض التهاب الأمعاء
Summary
نقدم هنا بروتوكولا للتحقيق أثر إبطال الجينات المتعلقة جوستيشن على الاستجابات المناعية في ديكستران كبريتات صوديوم (DSS)-التي يسببها التهاب الأمعاء المرض (بنك التنمية بين الأمريكتين) طراز الماوس.
Abstract
مرض التهاب الأمعاء (بنك التنمية بين الأمريكتين) هو واحد من الاضطرابات المعوية المتصلة بجهاز المناعة، بما في ذلك التهاب القولون التقرحي وداء كرون، الذي يؤثر على نوعية حياة الملايين من الناس في جميع أنحاء العالم. وتشمل أعراض بنك التنمية بين الأمريكتين الأم في البطن وإسهال ونزيف المستقيم، التي قد تنجم عن التفاعلات بين الحجمية القناة الهضمية والمكونات الغذائية، والخلايا الظهارية المعوية، والخلايا المناعية. أنها ذات أهمية خاصة لتقييم كيفية تأثير كل الجينات الرئيسية المعرب عنها في الخلايا الظهارية والمناعة المعوية التهاب في القولون. ز مستقبلات الذوق إلى جانب البروتين، بما في ذلك ز البروتين الوحيدات α-جوستدوسين وغيرها من البروتينات إرسال الإشارات، وقد تم العثور عليها في الأمعاء. هنا، نحن نستخدم α-جوستدوسين كممثل ووصف ديكستران كبريتات صوديوم (DSS)-التي يسببها نموذج بنك التنمية بين الأمريكتين لتقييم أثر طفرات الجينات تطرب على حصانة المخاطي الأمعاء والتهاب. هذا الأسلوب يجمع بين تكنولوجيا الجينات خروج المغلوب مع نموذج بنك التنمية بين الأمريكتين المستحث كيميائيا، وهكذا يمكن تطبيقها لتقييم نتائج إبطال الجين تطرب، فضلا عن الجينات الأخرى التي قد تكون اكسبيريت أو تثبيط الاستجابة المناعية الناجمة عن مفاجآت في القولون. وتدار الفئران متحولة مع إدارة السلامة والأمن لفترة زمنية معينة ترصد وتسجل خلالها وزن الجسم، والبراز، ونزيف المستقيم. في تيميبوينتس مختلفة أثناء الإدارة، هي euthanized بعض الفئران، ثم يتم قياس الأحجام والأوزان الطحال والفواصل وأنسجة القناة الهضمية وتم جمعها وتجهيزها لغذائها وتحليل التعبير الجيني. تظهر البيانات أن النتائج خروج المغلوب α-جوستدوسين في فقدان الوزن الزائد والإسهال والنزيف المعوي، وتلف الأنسجة والتهاب مقابل الفئران البرية من نوع. نظراً لشدة التهاب المستحث يتأثر بسلالات الماوس والبيئة السكنية، والنظام الغذائي، الاستغلال الأمثل لمفاجآت صيف دبي مدة التركيز والإدارة في تجربة رائدة مهم بشكل خاص. عن طريق ضبط هذه العوامل، يمكن تطبيق هذا الأسلوب لتقييم الآثار التحريضية المضادة والمحترفين على حد سواء.
Introduction
الأشكال الرئيسية اثنين من مرض التهاب الأمعاء (بنك التنمية بين الأمريكتين) وداء كرون (CD)، والتهاب القولون التقرحي (UC) تتميز بالأمراض المزمنة التحريضية تحويلات أو التدريجي من الأمعاء مع المسببات المتعددة العوامل1،2 . يعتمد تطوير بنك التنمية بين الأمريكتين على الوراثية وكذلك بعض العوامل البيئية مثل النظام الغذائي، استخدام المضادات الحيوية، والأهم من ذلك الالتهابات المسببة للمرض. ومع ذلك، لا تزال غير واضحة بالمسببات والآليات الجزيئية التنظيمية الأساسية لبنك التنمية بين الأمريكتين. ومن ثم، تم شيدت المستحث كيميائيا العديد من النماذج الحيوانية بنك التنمية بين الأمريكتين وتطبيقها لتحدد المرضية والآليات التنظيمية، وتقييم مدى فعالية العلاجات البشرية3.
مستقبلات الذوق ز إلى جانب البروتين مستقبلات (جبكرس) وتصنف إلى نوعين رئيسيين: النوع الأول (T1Rs)، والنوع الثاني (T2Rs) الذي كشف الحلو، وقلبي، ومركبات المريرة. طعم إشارات الشلالات تبدأ بربط تاستانت إلى T1Rs أو T2Rs، تفعيل هيتيروتريميريك ز البروتينات تتألف من α-جوستدوسين وديمر Gβγ وتؤدي إلى الإفراج عن مفارز Gβγ. مجموعة Gβγ يحفز بدوره المستجيب المصب إنزيم phospholipase ج-β2 (PLC-β2). تنشيط المجلس التشريعي الفلسطيني-β2 ثم هيدروليزيس فوسفاتيديلينوسيتول-4، 5-بيسفوسفاتي في اثنين من السعاة الثانوي داخل الخلايا [اينوزيتول-1,4,5-تريسفوسفاتي (IP3) و diacylglycerol]، والملكية الفكرية3 يربط إلى وفتح لها IP مستقبلات قناة3 R3، إطلاق أيونات الكالسيوم من هيولى. وهذا يؤدي في النهاية إلى فتح مستقبلات عابر المحتملة أيون قناة Trpm5 وإطلاق سراح ATP العصبي على أعصاب تذوق4،،من56،7. حتى الآن، مسارات إشارات من اﻷذواق المالحة وتعكر مختلفة ومستقلة من الحلو وقلبي والأذواق المريرة8. وبالإضافة إلى ذلك، مكونات طعم جبكرس والبروتينات المتلقين للمعلومات موجودة في الأنسجة خارج الفم المختلفة. أشارت الدراسات التي أجريت مؤخرا إلى أن α-جوستدوسين، يتم العثور على المكون الرئيسي للذوق إشارة، يعبر عنه في مخاطية الأمعاء. إجراء المزيد من الدراسات ضرورية لفهم وظائف طعم هذه الإشارات المكونات في الأنسجة خارج الفم9،10.
يتم استخدام الأسلوب الموصوفة هنا لتوصيف وظائف البروتينات مما يشير إلى تذوق المعرب عنه في الأنسجة خارج الفم. أن نجمع بين خط المعدلة وراثيا ماوس المتقدمة لتحديد الشلالات الإشارات في براعم الذوق مع نموذج القولون المستحث كيميائيا. إلى حد كبير نظراً لبساطته الإجرائية والتشابه المرضية لالتهاب القولون التقرحي البشرية، ديكستران كبريتات الصوديوم (DSS)-المستحث نموذج بنك التنمية بين الأمريكتين قد استخدمت على نطاق واسع بين مختلف نماذج القولون المستحث كيميائيا11. في هذه الدراسة، استخدمنا α-جوستدوسين-ناقص الفئران كخط ماوس ممثل للكشف عن وظائف جديدة من α-جوستدوسين في القناة الهضمية حصانة المخاطي والتهاب 1) تحليل التغييرات الشكلية في الأنسجة و 2) فحص الاختلافات في التعبير عن السيتوكينات المتصلة بالتهاب في القولون. يمكن استخدام هذا الأسلوب كمياً ونوعيا تحديد مساهمات البروتينات مما يشير إلى تذوق (وغيرها من البروتينات التي أعرب عنها في القناة الهضمية) إلى تلف الأنسجة والتهاب الأمعاء، عند خطوط الماوس المعدلة وراثيا على جينات وتتوفر المصلحة. مزايا هذا الأسلوب هي تمكين المستخدمين من الحصول على بيانات متكاملة الناجمة عن تصرفات DSS الكيميائية ونقص الجينات للفائدة. يمكن زيادة تحسين هذا الأسلوب زيادة حساسيتها، وتكشف عن بعض التغييرات الطفيفة المعوية المستويات الخلوية والجزيئية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويمكن استخدام هذا الأسلوب إلى كوانتيتيفيلي تحديد أثر طفرات الجينات تذوق محددة على التهاب في طراز ماوس المستحثة بمفاجآت بنك التنمية بين الأمريكتين. للاستفادة الكاملة، التعريف الأمثل لبنك التنمية بين الأمريكتين خطوة أساسية. تطوير التهاب القولون يتأثر بالعديد من العوامل، بما في ذلك سلالة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا العمل من المنح المقدمة من الوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة من الصين (81671016 و 31471008 و 31661143030)، والمعاهد الوطنية للصحة (DC010012، DC015819) ومؤسسة Siyuan.
Materials
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. | ||
References
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory Bowel Disease. Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).
- Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).
- Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases. Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Gilbertson, T. A., Khan, N. A. Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges. Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).
- Huang, L., et al. Gγ13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium. Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).
- Perez, C. A., et al. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).
- Shigemura, N., Ninomiya, Y. Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying. International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).
- Bezençon, C., et al. Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells. Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).
- Lu, P., Zhang, C. -. H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. Extraoral bitter taste receptors in health and disease. The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).
- Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 104 (25), (2014).
- Feng, P., et al. Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein α-gustducin. Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).
- Feng, P., et al. Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).
- Axelsson, L. -. G., Landström, E., Goldschmidt, T. J., Grönberg, A., Bylund-Fellenius, A. -. C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).
- Egger, B., et al. Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency. Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
