Virkningerne af smag signalerer Protein afskaffelse på Gut betændelse i en inflammatorisk tarm sygdom musen Model
Summary
Her præsenterer vi en protokol for at undersøge effekten af annulleringen af gustation-relaterede gener på immunrespons i en dextran sulfat natrium (DSS)-induceret inflammatoriske tarm sygdom (IBD) musemodel.
Abstract
Inflammatorisk tarmsygdom (IBD) er en af de immun-relaterede gastrointestinale lidelser, herunder colitis ulcerosa og Crohns sygdom, der påvirker livskvalitet for millioner af mennesker verden over. IBD symptomer omfatter smerter i underlivet, diarré, og rektal blødning, som kan følge af samspillet mellem gut mikrobiota, LEVNEDSMIDDELBESTANDDELE, intestinal epitelceller og immunceller. Det er særligt vigtigt at vurdere, hvordan hver nøglen gen udtrykt i tarm epitel og immun celler påvirker betændelse i tyktarmen. G protein koblede smag receptorer, herunder G protein-underenheder α-gustducin og andre signaling proteiner, er blevet fundet i tarmene. Her bruger vi α-gustducin som en repræsentant og beskrive en dextran sulfat natrium (DSS)-induceret IBD model til at vurdere effekten af gustatoriske genmutationer på gut mucosal immunitet og betændelse. Denne metode kombinerer genteknologi knockout med de kemisk inducerede IBD model, og dermed kan anvendes til at vurdere resultaterne af gustatoriske gen annulleringen samt andre gener, der kan exuberate eller dæmpe den DSS-induceret immunrespons i tyktarmen. Mutant-mus administreres med DSS i en vis periode, hvor deres kropsvægt, taburet og rektal blødning er overvåget og registreret. Ved forskellige timepoints under administration, nogle mus er euthanized, derefter størrelser og vægte af deres milt og koloner måles og gut væv er indsamlet og behandlet histologiske og gen expression analyser. Dataene viser, at α-gustducin knockout resultater i overdreven vægttab, diarré, intestinal blødning, vævsskader og betændelse vs. wild-type mus. Da sværhedsgraden af induceret inflammation er ramt af musen stammer, boliger miljø og kost, er optimering af DSS koncentration og administration varighed i et pilotprojekt særlig vigtig. Ved at justere disse faktorer, kan denne metode anvendes til at vurdere både anti – og pro-inflammatoriske effekter.
Introduction
De to vigtigste former for inflammatorisk tarmsygdom (IBD), Crohns sygdom (CD) og colitis ulcerosa (UC) er karakteriseret ved kronisk remittent eller progressive betændelsestilstande i tarmen med multifaktoriel ætiologi1,2 . Udviklingen af IBD afhænger af genetiske samt visse miljømæssige faktorer som kost, brug af antibiotika, og vigtigere, patogene infektioner. Ætiologi og regulerende molekylære mekanismer bag IBD er dog stadig uklart. Derfor, mange kemisk inducerede IBD dyremodeller er blevet konstrueret og anvendes for at afgrænse patogenese og reguleringsmekanismer og vurdere effektiviteten af menneskelige therapeutics3.
Smag receptorer er G protein koblede receptorer (GPCRs) og er klassificeret som to hovedtyper: type I (T1Rs), og type II (T2Rs), der registrerer sweet, umami og bitter forbindelser. Smag signaling cascades er initieret af tastant binding til T1Rs eller T2Rs, aktivering af heterotrimeric G proteiner består af α-gustducin og en Gβγ dimer og fører til frigivelse af Gβγ underenheder. Gβγ gruppe stimulerer igen downstream effektor enzym fosfolipase C-β2 (PLC-β2). Aktiveret PLC-β2 derefter hydrolyserer phosphatidylinositol-4,5-bisfosfat i to intracellulære sekundære messengers [inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3) og diacylglycerol] og IP3 binder sig til og åbne sin kanal-receptor IP3 R3, frigivelse af calciumioner fra det endoplasmatiske reticulum. Dette fører i sidste ende til åbningen af forbigående receptor potentielle ion-kanal Trpm5 og udgivelse af neurotransmitteren ATP på gustatoriske nerver4,5,6,7. Den signaling veje af salt og Sure smag er dog forskellige og uafhængige fra sweet, umami og bitter smag8. Derudover findes komponenter af smag GPCRs og downstream proteiner i forskellige ekstra mundtlige væv. Nylige undersøgelser vist, at α-gustducin, er den vigtigste komponent i smag signalering, fundet skal udtrykkes i tarmslimhinden. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at forstå funktionerne af disse smag signalerer komponenter i ekstra mundtlige væv9,10.
Metoden beskrevet her bruges til at karakterisere funktioner af gustatoriske signaling proteinerne udtrykt i ekstra mundtlige væv. Vi kombinerer en Transgene mus linje udviklet til skildrer signaling cascades i smagsløg med kemisk inducerede colitis model. I vid udstrækning skyldes dens proceduremæssige enkelhed og patologiske ligheder med menneskelige colitis ulcerosa, dextran sulfat natrium (DSS)-induceret IBD model har været mest udbredt blandt de forskellige kemisk inducerede colitis modeller11. I denne undersøgelse brugte vi α-gustducin-mangelfuld mus som en repræsentativ mus linje til at afsløre nye funktioner af α-gustducin i tarmen mucosal immunitet og betændelse af 1) analyserer morfologiske forandringer i væv og 2) boltpistoler forskelle i udtryk for cytokiner relateret til betændelse i tyktarmen. Denne metode kan bruges til kvantitativt og kvalitativt bestemme gustatoriske signaling proteiner (og andre proteiner, udtrykt i tarmen) bidrag til vævsskader og tarmbetændelse, når genetisk modificerede mus linjer for gener interesse er tilgængelige. Fordelene ved denne metode muliggører brugernes hen til opnå integrerede data som følge af handlinger af både den kemiske DSS og mangel på gen af interesse. Denne metode kan forbedres yderligere for at øge sin følsomhed og afslører subtile intestinal ændringer på cellulære og molekylære niveau.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne metode kan anvendes til kvantitativt fastslå effekten af mutationer af specifikke gustatoriske gener på betændelse i en DSS-induceret IBD musemodel. For at drage fuld fordel, er optimal induktion af IBD et vigtigt skridt. Udviklingen af colitis er påvirket af flere faktorer, herunder mus stamme, boliger miljø, intestinal mikroflora, samt gener af interesse. Det anbefales at udføre et pilotprojekt med et lille antal mus til at teste forskellige doser og varigheder af DSS administration. Under pilot eksperiment…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er støttet af tilskud fra National Natural Sciences Foundation of China (81671016, 31471008 og 31661143030) og National Institutes of Health (DC010012, DC015819) og Siyuan Foundation.
Materials
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. | ||
References
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory Bowel Disease. Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).
- Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).
- Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases. Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Gilbertson, T. A., Khan, N. A. Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges. Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).
- Huang, L., et al. Gγ13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium. Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).
- Perez, C. A., et al. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).
- Shigemura, N., Ninomiya, Y. Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying. International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).
- Bezençon, C., et al. Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells. Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).
- Lu, P., Zhang, C. -. H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. Extraoral bitter taste receptors in health and disease. The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).
- Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 104 (25), (2014).
- Feng, P., et al. Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein α-gustducin. Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).
- Feng, P., et al. Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).
- Axelsson, L. -. G., Landström, E., Goldschmidt, T. J., Grönberg, A., Bylund-Fellenius, A. -. C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).
- Egger, B., et al. Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency. Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
