ההשפעות של טעם איתות חלבון ביטול על דלקת מעיים במודל עכבר מחלות מעי דלקתיות
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לחקור את ההשפעה של הביטול של גנים הקשורים הטעימה על תגובות חיסוניות נתרן גופרתי לתוספי (DSS)-induced מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי) מחלת העכבר מודל.
Abstract
מחלות מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי) הוא אחד הקשורים החיסון בהפרעות עיכול, לרבות קוליטיס ומחלת קרוהן, זה משפיע על איכות החיים של מיליוני אנשים ברחבי העולם. מחלת המעי הדלקתי תסמינים כוללים כאבי בטן, שלשול, דימום רקטלי, אשר עלולים להיגרם כתוצאה האינטראקציות בין הבטן microbiota, רכיבי מזון, תאי אפיתל המעי, תאים חיסוניים. זה חשיבות מיוחדת כדי להעריך כיצד כל אחד הגנים המרכזיים מבוטא בתאי אפיתל ואת המערכת החיסונית משפיעה על דלקת במעי הגס. G-חלבון בשילוב הטעם קולטנים, כולל יחידת משנה חלבון G α-gustducin וחלבונים איתות אחרים, נמצאו במעיים. כאן, אנו משתמשים α-gustducin כנציג. ומתארות נתרן גופרתי (DSS) לתוספי-המושרה מחלת המעי הדלקתי דגם כדי להעריך את ההשפעה של מוטציות הטעם על חסינות הרירית בטן ודלקת. שיטה זו משלבת טכנולוגיה נוקאאוט גנטי עם המודל מחלת המעי הדלקתי המושרה מבחינה כימית, ובכך יכול להיות מיושם כדי להעריך את התוצאה של ג’ין הטעם שהביטול, כמו גם אחרות הגנים exuberate או לצנן את התגובה החיסונית DSS-induced במעי הגס. עכברים מוטנטים המנוהלים באמצעות DSS במשך תקופה מסוימת שבמהלכה שלהם משקל הגוף בצואה, דימום רקטלי נמצאים תחת פיקוח והקליט. ב timepoints שונים במהלך ניהול, עכברים מורדמים, מידות ומשקולות של טחולים שלהם נקודתיים נמדדים ואז בטן רקמות נאספים וכוח מעובד עבור היסטולוגית וניתוחים ביטוי גנים. הנתונים מראים כי התוצאות נוקאאוט α-gustducin מוגזמת במשקל, שלשול, דימום פנימי, נזק לרקמות, ועכברים דלקת לעומת פראי-סוג. מאז חומרת דלקת המושרה מושפע העכבר זנים סביבת מגורים, תזונה, אופטימיזציה של DSS משך ריכוז וניהול טייס ניסוי חשוב במיוחד. על-ידי התאמת גורמים אלה, בשיטה זו ניתן להחיל כדי להעריך את שני אפקטים אנטי, פרו-דלקתיים.
Introduction
בשתי הצורות הגדולות של מחלות מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי), מחלת קרוהן (CD) ו קוליטיס (UC) מאופיינים remittent או מתקדמת התנאים דלקתית כרונית של המעי עם אטיולוגיה multifactorial1,2 . ההתפתחות של מחלת המעי הדלקתי תלוי גנטי וכן מסוימים גורמים סביבתיים כגון: תזונה, שימוש באנטיביוטיקה, חשוב, זיהומים פתוגניים. עם זאת, אטיולוגיה של הרגולציה המנגנונים המולקולריים שבבסיס מחלת המעי הדלקתי עדיין אינם ברורים. לפיכך, רבים כימית המושרה מחלת המעי הדלקתי מודלים בעלי חיים יש כבר נבנה ומוחלים ניסחו את פתוגנזה ואת מנגנוני הרגולציה ולהעריך את האפקטיביות של אדם הרפוי3.
קולטני טעם G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs), מסווגים לשני סוגים עיקריים: מסוג I (T1Rs), ו II (T2Rs) המאתרות מתוק, של אמאמי ותרכובות מרירה. לטעום איתות cascades מבוצעים על ידי איגוד tastant T1Rs או T2Rs, מפעיל את heterotrimeric חלבוני G המורכב α-gustducin ו דיימר Gβγ ולהוביל אל-שחרור subunits Gβγ. Moiety Gβγ בתורו מגרה את הזרם אפקטור האנזים phospholipase C-β2 (PLC-β2). בקר לוגי מיתכנת מופעל-β2 ואז הידרוליזה phosphatidylinositol-4.5-bisphosphate לתוך שני שליחים משניים תאיים [אינוזיטול-1,4,5-טריפוספט (IP3) ו- diacylglycerol], ואת ה-IP3 איגודים כדי לפתוח את ה-IP ערוץ קולטן3 R3, משחרר יוני הסידן מן רשתית תוך-פלזמית. זה מוביל בסופו של דבר את הפתיחה של תעלת יונים פוטנציאלי קולטן ארעי, Trpm5 ואת שחרורו של הנוירוטרנסמיטר מ- ATP על העצבים הטעם4,5,6,7. ובכל זאת, המסלולים איתות של טעם מלוח, חמוץ הם שונים ועצמאית מתוק, של אמאמי, טעם מריר8. בנוסף, מרכיבי טעם GPCRs וחלבונים במורד הזרם קיימים ברקמות שונות אקסטרה אוראלי. מחקרים שנעשו לאחרונה הצביעו α-gustducin הזה, המרכיב העיקרי של טעם איתות, נמצא להתבטא רירית המעי. מחקרים נוספים נדרשים להבין את הפונקציות של אלה טעם איתות רכיבים רקמות הפה במיוחד9,10.
השיטה המתוארת כאן נעשה שימוש כדי לאפיין פונקציות של החלבונים איתות הטעם לידי ביטוי רקמות הפה במיוחד. אנו משלבים קו העכבר הטרנסגניים שפותחו עבור בהתוויית מפלים איתות-בלוטות הטעם עם המודל קוליטיס כימית המושרה. במידה רבה בשל שלה פשטות פרוצדורלי פתולוגיים דמיון אנושי קוליטיס, לתוספי חומצה גופרתית נתרן (DSS)-מודל מחלת המעי הדלקתי המושרה כבר בשימוש נרחב ביותר בין ה מודלים שונים מבחינה כימית המושרה קוליטיס11. במחקר זה, השתמשנו חשוכת-α-gustducin עכברים כקו נציג העכבר כדי לחשוף את פונקציות הרומן של α-gustducin חסינות הרירית בטן ודלקת ע י 1) ניתוח שינויים מורפולוגיים ברקמה 2) assaying הבדלים בביטוי של ציטוקינים הקשורים לדלקת במעי הגס. בשיטה זו ניתן להשתמש באופן כמותי ובאופיו לקבוע את התרומות של חלבוני איתות הטעם (וגם לחלבונים אחרים הביעו בבטן) נזק לרקמות, דלקת מעיים, כאשר העכבר מהונדסים קווים על הגנים של הריבית הינם זמינים. היתרונות של שיטה זו הם המאפשר למשתמשים לקבל נתונים משולב הנובע פעולות הן כימי DSS ועל מחסור של הגן עניין. בשיטה זו ניתן לשפר עוד יותר כדי להגביר את הרגישות שלה לחשוף שינויים עדינים מעיים ברמות תאית ומולקולרית.
Protocol
Representative Results
Discussion
בשיטה זו יכול להיות מועסק כדי quantitively לקבוע את ההשפעה של מוטציות של גנים ספציפיים הטעם על דלקת במודל של עכברים DSS-induced מחלת המעי הדלקתי. כדי לנצל את מלוא היתרונות, אינדוקציה אופטימלית של מחלת המעי הדלקתי היא צעד המפתח. התפתחות דלקת המעי הגס מושפע במספר גורמים, כולל עכבר זן, סביבת דיור, microflora מ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (81671016, 31471008 ו 31661143030), מכוני הבריאות הלאומיים (DC010012, DC015819) על ידי קרן Siyuan.
Materials
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. | ||
References
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory Bowel Disease. Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).
- Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).
- Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases. Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Gilbertson, T. A., Khan, N. A. Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges. Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).
- Huang, L., et al. Gγ13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium. Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).
- Perez, C. A., et al. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).
- Shigemura, N., Ninomiya, Y. Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying. International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).
- Bezençon, C., et al. Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells. Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).
- Lu, P., Zhang, C. -. H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. Extraoral bitter taste receptors in health and disease. The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).
- Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 104 (25), (2014).
- Feng, P., et al. Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein α-gustducin. Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).
- Feng, P., et al. Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).
- Axelsson, L. -. G., Landström, E., Goldschmidt, T. J., Grönberg, A., Bylund-Fellenius, A. -. C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).
- Egger, B., et al. Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency. Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
