Summary

선 동적인 장 질병 마우스 모델에서 창 자 염증 단백질 폐지를 신호 하는 맛의 효과

Published: November 09, 2018
doi:

Summary

여기에 우리가 dextran 황산 나트륨 (DSS)에 면역 반응에 맛보기 관련 유전자의 무효의 효과 조사 하기 위해 프로토콜을 제시-선 동적인 장 질병 (IBD) 마우스 모델을 유도.

Abstract

선 동적인 장 질병 (IBD)는 면역-관련 위장 장애, 궤 양성 대 장 염 및 Crohn의 질병, 전세계 사람들의 수백만의 삶의 질에 영향을 주는 등 중 하나입니다. IBD 증상 복 통, 설사, 직장 출혈, 본질적인 microbiota, 음식 구성 요소, 장 상피 세포, 면역 세포 간의 상호 작용에서 발생할 수 있습니다. 그것은 장 상피와 면역 세포에 표현 된 각 주요 유전자는 콜론에 염증에 미치는 영향을 평가 하기 위해 특별 한 중요성 의입니다. G 단백질 결합 맛 수용 체, G 단백질 소 단위 α-gustducin와 다른 신호 단백질을 포함 하 여 창 자에서 발견 되었습니다. 여기, 우리가 사용 하 여 α-gustducin 대표 dextran 황산 나트륨 (DSS) 설명-창 자 점 막 면역과 염증에 미각 유전자 돌연변이의 효과 평가 하 IBD 모델을 유도. 이 메서드는 화학적으로 유도 된 IBD 모델 유전자 녹아웃 기술을 결합 하 고 따라서 다른 유전자를 exuberate 수 있습니다 또는 콜론에 DSS 유도 된 면역 반응을 저해할 뿐 아니라 미각 유전자 무효의 결과 평가에 적용할 수 있습니다. 돌연변이 쥐를 일정 기간 동안 자신의 몸 무게의 자, 직장 출혈 모니터링 및 기록에 대 한 DSS와 함께 관리 됩니다. 관리 하는 동안 다른 timepoints에서 일부 마우스 안락사는, 크기 및 그들의 spleens와 콜론의 무게 측정 그리고 창 자 조직 수집 및 처리 조직학 및 유전자 표정 분석. 데이터는 과도 한 체중 감소, 설사, 장 출혈, 조직 손상 및 염증 야생-타입 마우스에 α-gustducin 녹아웃 결과 표시. 마우스 긴장, 주택 환경, 그리고 다이어트에 의해 유발된 염증의 심각도 영향을 DSS 농도 및 관리 기간 파일럿 실험의 최적화가 특히 중요 합니다. 이러한 요소를 조정 하 여 두 안티-과 프로-염증 성 효과 평가 하기 위해이 메서드를 적용할 수 있습니다.

Introduction

선 동적인 장 질병 (IBD), (CD), 크 론 병 및 궤 양성 대 장 염 (UC)의 두 가지 주요 형태는 multifactorial 병 인1,2 장의 만성 remittent 또는 진보적인 선 동적인 조건 특징 . IBD의 개발 다이어트, 항생제 사용, 같은 유전자로 특정 환경 요인에 따라 달라 집니다 중요 한 병원 성 감염. 그러나, 병 인 및 IBD 기본 규정 분자 메커니즘 여전히 명확 하지 않다. 따라서, 많은 화학적으로 유도 된 IBD 동물 모델이 건설 고 pathogenesis 및 규제 메커니즘 윤곽을 그리 다 고 인간 치료제3의 효과 평가에 적용 되었습니다.

맛 수용 체 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs) 이며 두 가지 주요 유형으로 분류 됩니다: 난 (T1Rs)을 입력 하 고 유형 II (T2Rs) 달콤한, umami, 그리고 쓴 화합물을 검출 하는. 맛 신호 폭포 tastant 바인딩 T1Rs 또는 T2Rs, 활성화는 heterotrimeric G 단백질의 α-gustducin와 Gβγ 이합체로 구성 된와 Gβγ subunits의 출시를 선도 시작 됩니다. Gβγ moiety 차례로 다운스트림 이펙터 효소 phospholipase C-β2 (PLC-β2) 자극. 활성화 된 PLC-β2 phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate 두 세포내 이차 메신저 [이노 시 톨-1,4,5-trisphosphate (IP3) 및 diacylglycerol], 그리고 IP3 바인딩 하로 hydrolyzes 그리고의 채널 수용 체 IP3 열 R3, 바인딩과 그물에서 칼슘 이온을 방출. 결국 일시적인 수용 체 잠재력 이온 채널 Trpm5의 열고 릴리스는 미각 신경4,,56,7에 신경 전달 물질 ATP의 리드. 그러나, 짠 맛과 신 맛의 신호 경로, umami, 다 정하고 쓴 맛8에서 다르고 독립적인 있습니다. 또한, 맛 GPCRs의 구성 요소 및 다운스트림 단백질 다양 한 여분 구강 조직에 존재합니다. 최근 연구는 α-gustducin 표시, 맛 신호의 주성분 장내 점 막에서 표현 될 발견 된다. 더 연구는 이러한 맛 신호 구성 요소 추가-구강 조직을9,10의 기능을 이해 필요 합니다.

여기에 설명 된 메서드 외 구강 조직에 표현 하는 미각 신호 단백질의 기능을 특성화 하는 데 사용 됩니다. 우리는 화학적으로 유도 된 대 장 염 모델 입맛에 신호 폭포를 묘사에 대 한 개발 된 유전자 변형 마우스 선 결합. 절차적 결함과 인간의 궤 양성 대 장 염을 병 적인 유사성 때문에 크게는 dextran 황산 나트륨 (DSS)-유도 IBD 모델은 다양 한 화학적으로 유도 된 대 장 염 모델11중 가장 널리 이용 되는. 이 연구에서 우리가 사용 α gustducin 불충분 한 쥐 대표 마우스 선으로 1) 조직의 형태학 적 변화를 분석 하 고 2)의 표현에 차이 시 금 창 자 점 막 면역과 염증에 α-gustducin의 소설 기능을 크린 시 토 킨 결에 염증에 관련 된 양적 및 질적으로 미각 신호 (단백질과 다른 단백질에에서 표현)의 기여 장 염증, 조직 손상 하 때 결정 유전자 변형된 마우스의 유전자에 대 한 라인이 메서드를 사용할 수 있습니다. 관심은 사용할 수 있습니다. 이 방법의 이점은 모두 화학 DSS의 행동 및 관심사의 유전자의 결핍에서 발생 하는 통합된 데이터를 얻기 위해 사용자가 활성화 됩니다. 이 방법은 그것의 감도 증가 하 고 세포 및 분자 수준에서 미묘한 장 변화를 공개를 더 개선할 수 있습니다.

Protocol

쥐를 포함 하는 모든 실험 검토 하 고 기관 동물 관리와 Zhejiang 대학 사용 위원회에 의해 승인 했다. 이 프로토콜을 수행 하기 전에 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하는 것이 좋습니다. 1입니다. 마우스 및 DSS의 준비 유지는 녹아웃 (α-gustducin-/-) 마우스 및 나이, 성별 및 몸 무게 일치 야생-타입 컨트롤 (α-gustducin+ +) 개별적으로 깨끗 한 장에 C57BL/6 쥐.?…

Representative Results

DSS 유도 IBD 절차 관리 3%에 의해 설립 되었다 DSS α-gustducin-녹아웃 (KO) 및 야생-타입 (WT) 쥐에 식용 수에서. WT 쥐에 비해, 녹아웃 쥐와 과도 한 체중 감소, 설사, 장 출혈 (그림 1) 더 가혹한 colitis 전시. 7 일 DSS 관리 후 조직의 무결성에 차이 H & E 조직학 방법으로 얼룩을 사용 하 여 분석 되었다 그리고 더 악화 조직 손상이 WT 쥐 ( 보다 녹아…

Discussion

이 메서드는 quantitively에 채택 될 수 있다 염증 DSS 유도 IBD 마우스 모델에서 특정 미각 유전자의 돌연변이의 효과 결정. 활용, IBD의 최적의 유도 중요 한 단계입니다. Colitis의 개발은 마우스 스트레인, 주택 환경, 장내 microflora, 뿐만 아니라 관심의 유전자를 포함 한 여러 요인에 의해 영향을 받습니다. 다른 복용량을 테스트 하는 쥐의 작은 숫자와 DSS 관리의 기간 파일럿 실험을 수행 하는 것이 좋습?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (81671016, 31471008, 및 31661143030) 및 건강의 국가 학회 (DC010012, DC015819)에서 교부 금에 의해 및 Siyuan 재단에 의해 지원 됩니다.

Materials

Antibody
CD45 BD Biosciences 550539
CD3 BD Biosciences 555273
B220 BD Biosciences 550286
CD11b BD Biosciences 550282
Ly6G BD Biosciences 551459
Reagent
Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) MP Biomedicals 2160110
Streptavidin-HRP complex BD Pharmingen 551011
H&E Staining Kit BBI Life Sciences E607318
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sangon Biotech B548117
FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) Roche 4913850001
MMLV Reverse Transcriptase, GPR Clontech,TaKaRa 639574
TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit  TaKaRa 9767
BD 10 ml Syringe BD Biosciences 309604
Instruments and equipment
balance
scissors 
forceps
centrifuge
qPCR machine
staining jars
Software
Imag-Pro Plus  Media Cybernetics, Inc. 

References

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Du, Y., Liu, Q., Luo, X., Zhao, D., Xue, J., Feng, P., Margolskee, R. F., Wang, H., Huang, L. Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model. J. Vis. Exp. (141), e58668, doi:10.3791/58668 (2018).

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