Effekter av smak signalering Protein oppløsning på Gut betennelse i en inflammatorisk tarm sykdom musemodell
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å undersøke effekten av opphør av gustation-relaterte gener på immunreaksjoner i en dekstran sulfate natrium (DSS)-indusert inflammatorisk tarm sykdom (IBD) musemodell.
Abstract
Inflammatorisk tarmsykdom (IBD) er en av de immun-relaterte gastrointestinale lidelser, inkludert ulcerøs kolitt og Crohns sykdom, som påvirker livet kvalitet av millioner av mennesker over hele verden. IBD symptomer inkluderer magesmerter, diaré og endetarms blødning, som kan skyldes samhandlingene tarmen bakterieflora, mat komponenter, intestinal epitelceller og immunceller. Det er spesielt viktig å vurdere hvordan hver nøkkel gen uttrykt i intestinal epitel og immunsystemet cellene påvirker betennelse i tykktarmen. G protein-kombinert smak reseptorer, inkludert G protein delenhet α-gustducin og andre signalnettverk proteiner, har blitt funnet i tarmen. Her bruker vi α-gustducin som en representant og beskriver en dekstran sulfate natrium (DSS)-indusert IBD modell å evaluere effekten av gustatory genet mutasjoner på gut mucosal immunitet og betennelse. Denne metoden kombinerer knockout genteknologi med kjemisk indusert IBD modellen, og dermed kan brukes for å vurdere utfallet av gustatory genet annullering samt andre gener som kan exuberate eller dempe immunrespons DSS-indusert i tykktarmen. Mutant mus administreres med DSS for en bestemt periode der deres kroppsvekt krakk og endetarms blødning overvåkes og registrert. På ulike timepoints under administrasjon, noen mus er euthanized, da størrelser og tykkelser av deres spleens og kolon måles og gut vev er samlet inn og behandlet for histologiske og gene expression analyser. Dataene viser at α-gustducin knockout resultatene i overdreven vekttap, diaré, intestinal blødning, vevsskade og betennelse vs vill-type mus. Siden alvorlighetsgraden av indusert inflammasjon påvirkes av musen stammer, bolig miljø og kosthold, er optimalisering av DSS konsentrasjon og administrasjon varighet i et pilotprosjekt spesielt viktig. Ved å justere disse faktorene, kan denne metoden brukes til å vurdere både anti – og pro-inflammatoriske effekter.
Introduction
De to store formene for inflammatorisk tarmsykdom (IBD), Crohns sykdom (CD) og ulcerøs kolitt (UC) er preget av kronisk remittent eller progressiv inflammatoriske tilstander i tarmen med multifaktoriell etiologi1,2 . Utviklingen av IBD avhenger av genetisk samt visse miljømessige faktorer som kosthold, antibiotikumet use, og viktigst, sykdomsfremkallende infeksjoner. Men er etiologien og regulatoriske molekylære mekanismer underliggende IBD fortsatt uklart. Derfor er mange kjemisk indusert IBD dyremodeller bygget og brukt for å avgrense patogenesen og regulatoriske mekanismer og evaluere effektiviteten av menneskelig therapeutics3.
Smak reseptorer er G protein-kombinert reseptorer (GPCRs) og er klassifisert som to hovedtyper: Skriv inn jeg (T1Rs) og II (T2Rs) oppdage søt umami og bitre stoffene. Smak signalnettverk kaskader er initiert av tastant binding til T1Rs eller T2Rs, aktivere heterotrimeric G proteiner α-gustducin og en Gβγ dimer og fører til utgivelsen av Gβγ underenheter. Gβγ moiety stimulerer igjen nedstrøms effektor enzymet fosfolipase C-β2 (PLC-β2). Aktivert PLC-β2 så hydrolyzes phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate i to intracellulær sekundære budbringere [inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3) og diacylglycerol] og IP3 binder seg til og åpne kanalen-reseptor IP3 R3, slippe kalsiumioner fra det endoplasmatiske retikulum. Dette fører til slutt til åpningen av forbigående reseptor potensielle ion kanal Trpm5 og utgivelsen av nevrotransmitter ATP til gustatory nerver4,5,6,7. Likevel, signalveier av salte og sure smaker er forskjellige fra og uavhengige fra søt og umami bitter smak8. I tillegg finnes komponentene smak GPCRs og nedstrøms proteiner i ulike ekstra muntlig vev. Studier vist at α-gustducin, er den viktigste komponenten smak signalnettverk, funnet å bli uttrykt i tarmen. Videre studier er nødvendig for å forstå funksjonene til disse smak signalering komponenter i ekstra muntlig vev9,10.
Metoden beskrevet her brukes til å beskrive funksjonene til gustatory signalnettverk proteiner i ekstra muntlig vev. Vi kombinerer en transgene musen linje utviklet for skildre signalnettverk kaskader i smaksløkene med kjemisk indusert kolitt modellen. Hovedsakelig på grunn av sin fremgangsmåter for enkelhet og patologisk likheter med menneskelige ulcerøs kolitt, dekstran sulfate natrium (DSS)-indusert IBD modellen har vært mest brukt blant de ulike kjemisk indusert kolitt modeller11. I denne studien brukte vi α-gustducin-mangelfull mus som en representant musen linje for å avsløre romanen funksjoner α-gustducin i tarmen mucosal immunitet og betennelse av 1) analyserer morfologiske endringer i vevet og 2) assaying forskjeller i uttrykk for cytokiner relatert til betennelse i tykktarmen. Denne metoden kan brukes til kvalitativt og kvantitativt bidrag av gustatory signalnettverk proteiner (og andre proteiner i tarmen) skade på vev og tarm betennelse, når genmodifiserte musen linjer for genene for interesse er tilgjengelig. Fordelene ved denne metoden gjør det mulig for brukere å få integrerte data som følge av både den kjemiske DSS og mangel på genet av interesse. Denne metoden kan forbedres ytterligere å øke sin sensitivitet og avsløre subtile intestinal endringer på mobilnettet og molekylære.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne metoden kan brukes til å quantitively fastslå effekten av mutasjoner av bestemte gustatory gener på betennelse i en DSS-indusert IBD musemodell. For å utnytte, er optimal induksjon av IBD avgjørende. Utviklingen av kolitt påvirkes av flere faktorer, inkludert mus belastning, bolig miljø, tarm mikroflora, samt gener av interesse. Det anbefales å utføre et pilotprosjekt med et lite antall mus å teste ulike doser og varighet for DSS administrasjon. Under pilotprosjekt, brutto symptomer som vekttap, diaré, i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet er støttet av tilskudd fra nasjonale naturvitenskap Foundation of China (81671016, 31471008 og 31661143030) og National Institutes of Health (DC010012, DC015819) og av Siyuan Foundation.
Materials
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. | ||
References
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory Bowel Disease. Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).
- Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).
- Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases. Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Gilbertson, T. A., Khan, N. A. Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges. Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).
- Huang, L., et al. Gγ13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium. Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).
- Perez, C. A., et al. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).
- Shigemura, N., Ninomiya, Y. Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying. International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).
- Bezençon, C., et al. Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells. Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).
- Lu, P., Zhang, C. -. H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. Extraoral bitter taste receptors in health and disease. The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).
- Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 104 (25), (2014).
- Feng, P., et al. Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein α-gustducin. Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).
- Feng, P., et al. Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).
- Axelsson, L. -. G., Landström, E., Goldschmidt, T. J., Grönberg, A., Bylund-Fellenius, A. -. C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).
- Egger, B., et al. Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency. Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
