Efeitos de gosto sinalização Abolishment de proteína na inflamação do intestino em um modelo de Mouse de doença inflamatória intestinal
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para investigar o efeito da anulação dos genes relacionados com gustação sobre respostas imunes em uma de sódio sulfato de dextrano (DSS)-induzidas pelo modelo de mouse (IBD) de doença inflamatória intestinal.
Abstract
Doença inflamatória intestinal (IBD) é um dos distúrbios gastrointestinais imune-relacionados, incluindo a colite ulcerosa e doença de Crohn, que afeta a qualidade de vida de milhões de pessoas em todo o mundo. IBD os sintomas incluem dor abdominal, diarreia e sangramento retal, que pode resultar de interações entre a microbiota do intestino, componentes de alimentos, células epiteliais intestinais e células do sistema imunológico. É de particular importância para avaliar como cada gene chave expressado nas células epiteliais e imunes intestinais afeta inflamação no cólon. Receptores de sabor acoplado à proteína G, incluindo a subunidade α da proteína G-gustducin e outras proteínas de sinalização, foram encontrados nos intestinos. Aqui, usamos a α-gustducin como representante e descrever um de sódio sulfato de dextrano (DSS)-induzido modelo IBD para avaliar o efeito das mutações génicas gustativa na imunidade da mucosa do intestino e inflamação. Este método combina tecnologia de gene nocaute com o modelo IBD quimicamente induzido e, portanto, pode ser aplicado para avaliar o resultado da anulação do gene gustativa, bem como outros genes que podem exuberate ou diminuir a resposta imune induzida por DSS no cólon. Ratos mutantes são administrados com DSS durante um certo período durante o qual seu peso de corpo, fezes e sangramento retal são monitorados e registrados. Em diferentes momentos durante a administração, alguns ratos são sacrificados, em seguida, os tamanhos e pesos de seus baços e dois-pontos são medidos e tecidos do intestino são recolhidos e tratados para histológica e análises de expressão do gene. Os dados mostram que os resultados de nocaute de α-gustducin em perda de peso excessivo, diarreia, sangramento intestinal, dano tecidual e inflamação vs selvagem-tipo ratos. Desde que a gravidade da inflamação induzida é afectada por estirpes de rato, ambiente de moradia e dieta, otimização da duração de concentração e administração de DSS em um experimento piloto é particularmente importante. Ajustando estes fatores, este método pode ser aplicado para avaliar ambos os efeitos antie pro-inflamatórios.
Introduction
As duas principais formas de doença inflamatória intestinal (IBD), (CD) da doença de Crohn e colite ulcerativa (UC) são caracterizadas por condições inflamatórias remitente ou progressivas crônicas do intestino com etiologia multifatorial1,2 . O desenvolvimento do IBD depende de genéticas, bem como certos fatores ambientais como dieta, uso de antibióticos e importante, infecções patogênicas. No entanto, a etiologia e regulamentares mecanismos moleculares subjacentes IBD não são ainda claras. Daí, numerosos modelos animais quimicamente induzidos de IBD foram construídos e aplicados para delinear a patogênese e mecanismos reguladores e avaliar a eficácia da terapêutica humana3.
Receptores de sabor são receptores de acoplado à proteína G (GPCRs) e são classificados em dois tipos principais: tipo I (T1Rs), e tipo II (T2Rs) que detectam o umami, doce e amargos compostos. Cascatas de sinalização gosto são iniciadas por tastant proteínas de ligação a T1Rs ou T2Rs, ativando a Via G consistindo de α-gustducin e um dímero Gβγ e levando a liberação das subunidades Gβγ. A fracção Gβγ por sua vez estimula a jusante effector enzima fosfolipase C-β2 (PLC-β2). PLC-β2 registrados então hidrolisa fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato dois mensageiros secundários intracelulares [inositol-1, 4,5-triphosphate (IP3) e diacilglicerol] e IP3 liga a e abrir seu canal-receptor IP3 R3, liberando íons de cálcio do retículo endoplasmático. Eventualmente, isto leva para a abertura do canal de íon potencial transiente do receptor Trpm5 e liberação do neurotransmissor ATP para os nervos gustativos4,5,6,7. Ainda, as vias de sinalização dos sabores salgados e amargo são diferentes e independentes de doce, umami e gostos amargos8. Além disso, os componentes de sabor GPCRs e proteínas a jusante existem em vários tecidos extra orais. Estudos recentes indicaram que α-gustducin, o principal componente do sabor de sinalização, encontra-se a ser expressa na mucosa intestinal. Mais estudos são necessários para entender as funções destes gosto sinalização componentes em tecidos extra oral9,10.
O método descrito aqui é usado para caracterizar as funções das proteínas de sinalização gustativas, expressadas em tecidos extra orais. Combinamos uma linha de rato transgénico desenvolvida para delinear as cascatas de sinalização no paladar com o modelo de colite induzida quimicamente. Em grande parte devido à sua simplicidade processual e patológicas semelhanças com colite ulcerosa humana, o dextran sulfato de sódio (DSS)-induzido IBD modelo tem sido mais amplamente utilizado entre colite induzida quimicamente vários modelos11. Neste estudo, usamos camundongos deficientes em α-gustducin como uma linha representativa do mouse para revelar novas funções de α-gustducin na imunidade da mucosa do intestino e inflamação 1) analisando as alterações morfológicas no tecido e 2) diferenças na expressão de análise do citocinas relacionadas à inflamação no cólon. Esse método pode ser usado para quantitativamente e qualitativamente determinar as contribuições das proteínas de sinalização gustativas (e outras proteínas expressadas no intestino) dano tecidual e inflamação intestinal, quando o rato geneticamente modificado linhas para os genes da juros estão disponíveis. Vantagens deste método estão permitindo que os usuários obter dados integrados resultantes de ações de ambos os químicos DSS e deficiência do gene de interesse. Esse método pode ser melhorado para aumentar a sua sensibilidade e revelar alterações intestinais sutis a nível celular e molecular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método pode ser empregado para quantitativamente determinar o efeito das mutações de genes específicos gustativas na inflamação em um modelo do rato do IBD induzida em DSS. Para aproveitar ao máximo, indução ideal do IBD é um passo fundamental. O desenvolvimento da colite é afetado por vários fatores, incluindo a cepa de rato, ambiente de moradia, microflora intestinal, bem como os genes de interesse. Recomenda-se realizar um experimento piloto com um pequeno número de ratos para testar diferentes doses…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado por concessões do nacional ciências naturais Fundação da China (81671016, 31471008 e 31661143030) e o National Institutes of Health (DC010012, DC015819) e pela Fundação Siyuan.
Materials
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. | ||
References
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory Bowel Disease. Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).
- Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).
- Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases. Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Gilbertson, T. A., Khan, N. A. Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges. Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).
- Huang, L., et al. Gγ13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium. Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).
- Perez, C. A., et al. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).
- Shigemura, N., Ninomiya, Y. Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying. International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).
- Bezençon, C., et al. Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells. Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).
- Lu, P., Zhang, C. -. H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. Extraoral bitter taste receptors in health and disease. The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).
- Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 104 (25), (2014).
- Feng, P., et al. Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein α-gustducin. Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).
- Feng, P., et al. Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).
- Axelsson, L. -. G., Landström, E., Goldschmidt, T. J., Grönberg, A., Bylund-Fellenius, A. -. C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).
- Egger, B., et al. Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency. Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
